摘 要:本文综述了高通量筛选最新检测技术的原理,包括均相分析和细胞分析的检测原理及其在微量分析及高通量筛选中的应用。均相分析中应用较多的有亲合闪烁分析(SPA) 、荧光分析(FA) 等,而荧光分析技术主要包括荧光共振能量转移(ERT) ,荧光偏振(FP) ,时间分辨荧光(TR) 以及荧光相关谱(FRS) 等。细胞分析主要建立在荧光检测技术的基础上,包括第二信使分析,报告基因分析,细胞增殖分析等。高通量筛选技术的应用和发展,将会极大的促进新药研究的进程。
在药物研究过程中,先导化合物的发现是一个极为重要的过程。近年来,随着分子生物学的迅猛发展及功能基因组的出现,具有潜在治疗作用的靶标越来越多,组合化学技术使化合物库迅速扩大,这些促进了高通量筛选[1、2 ] (HTS) 自动化、微量化的迅速发展。
高通量筛选分析通常在96 孔板上进行,采用自动化技术对流体进行分配并对微孔板进行处理,化合物、药物活性的检测在微孔板中进行,这种分析模式至今仍被广泛采用,但许多研究机构已转向384 孔板或孔数更高、体积更小的分析模式[3、4 ] 。现今,国外许多制药公司已把高通量筛选作为发现先导化合物的主要手段。典型的高通量筛选模式为每次筛选1 000 个化合物[5 ] ,而超高通量筛选可每天筛选10 万多个化合物[6 ] 。随着分析容量的增大,分析检测技术、液体处理及自动化,还有连续流动以及信息处理已成为制约高通量筛选发展的瓶颈[7 ] 。因此,为减少成本和降低操作费用,高通量筛选须向自动化、分析微量化方向发展。微量分析可使每次分析时所用化合物及化学试剂减少,这样可增加高通量筛选的容量。同时,使样品同步处理和多种检测方式的应用成为可能。进行有效的微量分析通常有两种方法[6 ] :一是采用高密度、小体积的微孔板;二是设计可进行连续流动分析的微孔板。
高通量筛选分析主要包括均相分析和细胞分析,均相分析技术中应用较多的有亲合闪烁分析(SPA) 、荧光分析(FA)等技术。亲合闪烁分析(SPA) 在许多酶抑制分析和受体结合分析中被广泛应用[8 ] ,荧光检测技术因其固有的灵敏度,其在均相分析应用中也变得十分普遍[9、10 ] 。荧光分析技术主要包括荧光共振能量转移(ERT) ,荧光偏振(FP) ,时间分辨荧光(TR) 以及荧光相关谱(FRS) 等;细胞分析主要建立在荧光检测技术的基础上,包括第二信使分析,报告基因分析,细胞增殖分析等技术。
1 均相分析
由于均相分析减免了滤过、分离、冲洗等繁琐的难于自动化步骤,所以,它特别适用于高通量筛选[6 ] 。为减少分析体积,提高灵敏度,均相生化分析经常采用亲合闪烁分析或荧光检测技术。至于选择运用哪种技术,则往往取决于被分析靶标的分类,在进行细胞表面受体结合分析时要经常运用亲合闪烁分析技术,因为受体浓度低,所需亲合性高,分析要在很低的标记探针浓度下进行,所以要用到此技术。在酶分析和细胞分析中,经常要用到钙离子及其它离子的荧光性酶底物和荧光指示剂,即采用荧光检测技术。
1. 1 亲合闪烁分析(SPA) 亲合闪烁分析在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时,放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离,现已被亲合闪烁分析所取代[8 ] 。亲合闪烁分析技术通过亲合结合,将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上,从而产生光子,减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程,使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行,适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记,而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收,以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到[11 ] 。SPA 技术被广泛的应用到激酶[12、13 ] 、核酸处理酶分析[14 ]以及受体配体的相互作用[15～17 ]分析中。
1. 2 荧光分析 荧光检测方法灵敏是因为多数荧光基团都有短暂的半衰期,即使得用较弱的激发光源也能获得大量的光子流。这种特性以及多种可采用的荧光模式,使得荧光检测技术成为高通量筛选必不可少的应用手段[18 ] 。荧光技术在均相筛选分析中广为应用。其中,包括荧光共振能量转移(FRET) ,荧光偏振(FP) ,时间分辨荧光(TRET) 以及荧光相关谱(FCS) 等技术。
(1) 荧光共振能量转移(FRET) 是非放射性能量在适当分子能量给予体和接受体之间转移,当给予体激发态能量满足光学和空间上的要求时,其能量就能有效转移给接受体,包括给予体荧光发射光谱和接受体的吸收光谱显著重叠。给予体和接受体在同一直线上做偶极运动,且其分子间间隔距离比Forster 距离(能量有效转移率为50 %的间隔距离,通常为几十埃) 小[19 ] 。能量转移效率随给予体和接受体之间第六能级距离而成相反变化,故分子间小的空间变化(几个埃)能显著影响能量的有效转移率。这种现象已被利用到荧光性酶标底物的设计与合成中。通常,自然酶切序列的小肽被合成并在其反端用适当的分子给予体和淬灭剂予以标记。
在完整的底物中,给予体和淬灭剂保持的距离较近。这样, 非放射性能量转移效率高,给予体有效的荧光量子产率显著低于自由荧光基团。由于底物分子被酶切断及能量给予体和淬灭剂被冲走,通过测量荧光强度变化可以监测酶活性。Abriola 等在96 孔板和微孔板模式上,利用数字图像技术对荧光蛋白酶进行了平行分析[20 ] ; Kakiuchi 等利用荧光共振能量转移分析,对C 型肝炎病毒抑制剂进行了成功筛选[21 ] 。
(2) 荧光偏振(FP) 测定法能够测定结合到大分子上标记探针旋转散射系数的变化[22、23 ] 。当样品用偏振光激发时,FP可计算发射光强中平行和垂直偏振成分。当荧光标记配基和大分子之间的结合平衡建立后,偏振值会增加。因此,这种技术提供了一种受体- 配基、蛋白- 蛋白相互作用,以及标记底物酶催化水解等的快速均相分析法。Bolger 等利用荧光偏振法对雌激素受体进行了结合分析[24 ] ,而Seethala 等利用此技术对酪氨酸激酶进行了竞争性免疫分析[25 ] 。
(3) 荧光分析的灵敏度常受来源于试剂和容器等背景信号的限制。这时,可利用时间分辨技术来克服这一问题, 即采用时间分辨荧光技术分析(HTRF) 。稀土金属螯合物(如铕) 的荧光寿命通常为千分之一秒,而背景荧光寿命的数量级通常为ns。利用脉冲激发光源和门控检测器(或相调节技术) 可在样品荧光信号采集之前让背景荧光信号消失。均相时间分辨荧光分析(HTRF) ,是一种利用铕螯合物荧光寿命长和Stokes 位移明显的杂交技术[26 ] 。酪氨酸激酶的分析[27 ] ,以及在384 孔板上对新肿瘤坏死因子受体的筛选[28 ]等都应用到此技术。
(4) 荧光相关谱(FCS) 为较新的高通量筛选检测技术[29 ] 。通常,这种检测方法用共焦镜提供高聚激发光,并消除背景以做到单分子检测。共焦光学系统为微量化分析所不可缺少,因为,输出信号取决于荧光探针的检测体积(千万亿分之一升) 和浓度,而非总的分析体积。在探针浓度为nmol·L - 1时,任一给定时间内只有少数一些荧光分子在被检测液中。这时,由于分子的扩散作用,分子进出信号收集区而使信号发生瞬时波动。分子体积大小不同,扩散系数不一样,在检测体积中的逗留时间长短不同。小分子产生短荧光脉冲,而大分子产生荧光脉冲时间长。对这些取决于时间的荧光信号进行自动相关分析,可提供荧光粒子的扩散特征信息。由于荧光探针结合到另一分子上,导致其自身有效扩散系数的变化,这种技术能用来监测分子结合时的相互作用和其它分子事件。类似的荧光强度变化分析(如荧光强度分布分析) ,可提供荧光量子产率或谱移的变化信息,并可用来监测结合事件(当结合时的相互作用影响到这些特征时) ,数据的采集以及进行自动相关分析,约需1s 左右的时间来完成。该技术目前的局限在于其光学要求较高,使之与微板处理系统相结合起来比较困难。因此,常需运用显微镜来对微板进行制作, Koltermann 等利用此技术对核酸内酶的抑制进行了分析[30 ] 。
2 细胞分析
HTS 细胞分析分为三大类:监测信号转导激活细胞表面的受体的第二信使分析;在转录或翻译水平监测细胞反应的报告基因分析;探测细胞对外部刺激生长反应的细胞增殖分析。
2. 1 第二信使分析通常要测量快速短暂的荧光信号。多种荧光分子被用来检测细胞内的钙离子浓度、膜电位、pH 值等的变化,并被用来开展受体兴奋和离子通道激活等[31、32 ]第二信使分析。疏水电压敏感性探针和荧光共振能量转移兼容性微孔板,对筛选和发现作用于离子通道药物大有帮助。
2. 2 报告基因和增殖分析通常要几个小时的孵育步骤, 然后通过比色、荧光或发光检出。筛选通过同时、平行进行多种分析和优化检测步骤,使其总筛选量得到提高。报告基因技术是将酶基因或荧光蛋白连接到感兴趣的细胞上,通过激活靶基因导致该细胞和报告基因的表达,然后,再通过比色、荧光或发光检出。如通过荧光素酶的共同表达,来催化荧光素光发射反应,即是发光报告基因检测技术的一个应用例子。Diels 等[33 ]利用报告基因分析技术,对甾体类受体配基进行了分析,从中筛选出了该受体的拮抗剂和激动剂。Sharif等也利用荧光素酶报告基因技术,对蛋白激酶C 抑制剂进行了筛选,从中筛选出了针对人体细胞瘤的抗蛋白激酶C 增殖抑制剂[34、35 ] 。
3 微量分析的趋势
虽然流体分配技术及微板制作已经取得了很大的进步,在1536 孔板上进行筛选已成为现实,但发展和运行基于小体积、高密度微孔板的分析模式面临着许多技术上的难题。在开放体系中,随着表面积对体积比的增高,蒸发作用显著,而且毛细现象也影响了分析体积的准确性及分析时的浓度,加上目前流体分配技术的限制,有些分析在这种模式下可能根本不能完成[36 ] 。所以,要想发展超高通量筛选,就得突破目前这种微孔板的分析模式。
近来,微流芯片[37、38 ]的发展可能会导致高通量筛选技术的新变化。微流芯片技术利用半导体工业中的影印石版和蚀刻技术,在玻璃或熔融石英底物上制作10～100mm 的微流通路,利用电动泵和水压来控制纳升级的液体流动,使样品的平行处理和减少试剂的消耗,以及同时完成分析检测和提高数据质量成为可能。多种不同分析模式已经在其原型仪器上证明切实可行,包括结合分析[39、40 ] ,酶分析[41～43 ]和细胞分析[44、45 ] 。Caliper 技术公司设计并完成了第一代微流芯片的制作,而且,进行了相关试验。其将混有酶标底物和荧光性酶底物的化合物,通过微流芯片的熔融石英毛细管注入,当混合物流经微流通路时,反应可以进行。通常,利用样品进样环10～30s 可进样1～4nl 。酶与荧光性底物反应产生荧光信号基线,若试验化合物抑制酶的活性,则荧光信号会暂时降低。这种系统能用试剂冲洗微流芯片,并可进行成千上万个化合物的筛选。
微流芯片当前的发展主要集中在提高系统强度和将新型分析向连续流动微流芯片模式发展。新微流芯片将流体的处理和化合物冲洗及分析功能集于一身(允许使用者从二甲亚砜里直接进样,并在芯片里直接进行化合物冲洗) ,这样,就消除了目前实验室在筛选操作中的瓶颈—微孔板的制作。
4 展望
高通量筛选是发现先导化合物的重要途径,依据目前可得到的人类基因组信息及相关疾病的有关受体的识别和确认, 还有计算机辅助药物设计这一利用推理性药物设计方法的应用,将会极大的促进新药研究的进程。新微流芯片筛选技术的发展代表微量化分析质的飞跃,它将纳升级流体处理、化合物冲洗和分析功能、电泳分离检出、荧光检测技术有机的组合在一起,有望使药物高通量筛选过程有一个全新的进展。
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