摘 要:综述氯霉素转乙酰酶(CAT) 、β－半乳糖苷酶(β-gal) 、β－葡萄糖苷酸酶(p-GUS) 、分泌型碱性磷酸酶(SEAP) 、荧光素酶(luc) 、绿荧光蛋白( GFP) 等报告基因系统研究与应用进展; 简要介绍主要报告基因分析系统商品化试剂盒的研制及其应用范围和优缺点。
在研究基因功能的过程中,不可避免地要研究基因的调控机制,基因的表达产物非常复杂而难以对其定量和定性。要在细胞的生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更是非常困难。但研究者发现了一种简单的研究基因调控的方法[ 1 ] 即报告基因分析系统。报告基因分析系统的发现给基因的调控与表达的研究带来了新的希望,短短的几年,报告基因系统的研究也取得了快速的发展,本文将对报告基因的研究进展做一综述。
1.报告基因的研究背景
对真核基因的调控的了解,主要来自野生型和突变型的假定顺式作用调控元件的活性测定实验,这些实验是在转染的真核细胞中进行的。转录的起始点,可以通过对mRNA5′端在模板DNA 中的确切位置进行作图来决定,这些技术包括:引物延伸分析、DNA : RNA 杂交体的S1 核酸酶消化以及RNA :RNA 杂交体的RNA 酶A 消化等。但直接测定RNA 的丰度及结构,有一个大的问题:由于需要纯化并通过杂交和电泳来分析各种不同的RNA ,将是一个很大的工程。因此,在大多数情况下不直接测定调控元件的调节转录速率的能力,而是把顺式调控元件与一种编码新的产物的,被称为报告基因的基因序列连接起来,在基因的转录过程中,测定报告基因的转录产物的量,来判断顺式调控元件的调控能力。虽然这是一个间接的方法,但却是一种可行,而且有时是唯一的方法。作为报告基因必须具备以下特点:1. 由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别;2. 细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测:3. 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好[ 2 ] 。到目前为止,报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连,先让质粒在大肠杆菌中进行增殖,再提取质粒,转染入感兴趣的真核细胞中。与此同时还要将一有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒,共转染同一细胞,以作为转染率的内对照。在转染后的适当的时间内,检测报告基因的mRNA、编码的蛋白质或编码的酶的活性。通常检测这些产物需要破坏细胞,但也可以通过原位杂交或细胞培养物上清液来检测,甚至活细胞通过流式细胞仪进行检测。理想的检测方法应该是灵敏、简单、安全、经济、快速和重现性好。选择何种报告基因系统应根据研究的目的(基因表达调控或转染效率的测定?) 、组织与细胞的类别、信号检测的时间性与空间性(temporal versus spatial) 以及首选的检测方法,如:组织化学法(histochemical staining)、液闪法( 1iquid scintillometry) 、分光光度法( spectrophotometry) 、发光计法(1uminometry) 。目前已有很多的方法用于报告基因的测定如:比色法(colorimetry) 、荧光法(fluorescent) 、生物发光法(bioluminescent) 、化学发光法(chemiluminescent) 、酶联免疫法( ELISA) 及原位染色法(in situ staining) 及流式细胞仪法[ 3 ] 。
2.报告基因的种类
2. 1 氯霉素转乙酰酶报告基因(chlormnphenicol acetyltransferase ,CAT) 细菌的CAT 酶能将乙酰基从乙酰辅酶A 转移到氯霉素上,而使其失去抗菌性。该反应能通过测量放射性标记的底物而量化。放射性同位素标记底物有3H 标记的乙酰辅酶A 和14C 标记的氯霉素或荧光素标记的其中之一。CAT 抗体因可以用于EL ISA 法检测CAT ,所以也广泛用于该反应的检测,虽然CAT 的测定只能用细胞提取物进行,且测定的范围很窄,且可能有放射性同位素的污染,而限制了它的应用,但由于它在真核细胞中的本底很低,结果的重现性很好及灵敏度很高,而在进行表达的改变的研究中仍广泛应用。目前有很多著名公司生产有CAT 分析系统的商品试剂盒。如Amersham
Pharmacia Biotech 公司曾经生产(2002 年的产品目录上已经不存在了!) 的Quan2T2CATTM Assay System ,该试剂盒检测3H 标记的乙酰辅酶A 和生物素标记的氯霉素,使用者只需用试剂盒提供的链亲和素包被的聚苯乙烯株俘获氯霉素,再通过液闪法测定放射性计数,即可计算出CAT 活性。据称,该方法的灵敏度是14C 为底物方法的30 倍。作为改进Stratagene 公司的PathDetect trans-reporting systems 试剂盒可有多种报告基因选择,如CAT ,hr2GFP ,SEAP 等,且提供一种高转染率的受体细胞,最大的优点是能进行反式转录因子的测定,且灵敏度高、本底小及检测方法简单。Promega 公司也生产有pCAT3 全套试剂盒,与该公司既往生产的同类载体相比,适当改变了多克隆酶切位点,使其更加易于插入目的片段。另外,该试剂盒的CAT 分析法,有放射性同位素标记和荧光素标记两种选择方法。
2. 2 β-半乳糖苷酶报告基因(β-galatosidase ,β-gal) [ 4 ] 由大肠杆菌编码的β-gal 能水解乳糖为半乳糖。虽然在很多细菌、植物和动物细胞中存在较高的本底,而限制了它的使用,但还是常常用做转染的参照体系。通过使用特定的方法,还能够区别内外源性的β-gal (主要是改变缓冲液的pH 至8. 0),有公司生产有专门的试剂盒来区分内源性与外源性的β-gal 如ICNBiomedical 公司既往生产(2002 年产品目录未列) 的AuroraTM Ga I2XE kit 。有很多种方法来检测β-gal :比色法(colorimetric)、荧光法(fluorescent) ,及化学发光法(chemiluminescent) 。大致原理为β-gal 水解ONPG ( o-nitrophenyl-β-D-galactoside )或CPRG(chlorophenol redβ-D-galactoside) 产生颜色的改变,而能被分光光度计所检测,在原位组化中β-gal 能水解X－gal (5－bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside) 产生蓝色的沉淀,或将底物改为荧光素源物质如MU G(β-methyl umbelliferyl galactoside) 及FDG(fluorescein digalactoside) 而能在显微镜下观察到。另外,Molecular Probes 公司的FluoReportr.lacZ Flow Cytometly Kits 试剂盒及Marker Gene Technologies 公司的in vivolaeZβ-galactosidase Detection Kit 试剂盒均能用流式细胞仪(flow cytometry) 或共聚焦显微镜进行快速检测。但FDG做为底物有一个缺点, FDG及其荧光水解衍生物,在生理条件下,很快从细胞中排出。为解决此缺点MGT 公司将试剂盒加上一冷冻的步骤。很多公司为此改进了试剂盒的操作步骤,或加入细胞稳定剂如thiol-reactive chloromethyl group ,该基团能与半胱氨酸或细胞内的巯基基团结合形成肽一荧光素结合物,使荧光染料不易很快被排出细胞。ImaGene Green 与lmaGene RedlacZ Gene Expression Kits 均用含12 个碳原子的亲脂性基团结合荧光素,使亲脂性的“尾巴”结合在细胞膜上,而不易被排出。另外还有的公司使用化学发光法检测β-gal 如Applied Biosystems 的Galacto-Light TM and Galacto-Light PlusTM kits。Novagen 公司也生产有fluorometric BetaFluorTM b-Galactosidase Assay 其灵敏度达500fg。
2. 3 β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase ,β2GUS) 报告基因[ 5 ]
GUS 为大肠杆菌的又一水解酶,它能水解葡萄糖苷酸。该报告基因主要用于缺乏该酶的病毒性植物病原体、植物、酵母、及真菌等的研究中,在医学研究中相对应用较少。ICN 公司的Aurora GUS 试剂盒可以用于植物和动物细胞的报告基因分析。另外该试剂盒中应用了MUG(4- methylumbelliferyl-β-D-glucuronide) 使实验的灵敏度比同类的荧光分析更加灵敏,且能使存在动植物细胞中的荧光本底降低很多。
2. 4 分泌型碱性磷酸酶( secreted alkaline phosphatase ,SEAP)报告基因[ 7 ,8 ] 。
该酶为人胎盘碱性磷酸酶( human placental alkaline phosphatase ,PLAP) 的突变体,也有从北大西洋海域中的耐热细菌中分离出耐热型AP。由于该酶能由表达细胞分泌到细胞外,而被最近的研究者认为最具有前途的一种报告基因,近年来对此的研究也较多[ 7 、8 ] 。由于该酶能分泌到细胞外,在检测时,可以在不破坏细胞的情况下,任意时间都可以取细胞培养上清液进行重复的,动态的检测,且被检测细胞还可以用做其它的用途。由于SEAP 为PLAP 的突变体,使其具有了耐热特性,而且在L-高精氨酸(L-homoarginine) 存在下也具有不变的活性。这样,只要将培养物经热处理和在反应体系中加入L2高精氨酸,就可以彻底将内源性的AP 灭活。Applied Biosystems 公司的Phospha-Light TM kit 使用一种被称为CSPD.的底物,能检测到低达10 - 21摩尔的SEAP 酶。ICN 公司的Aurora AP kit ,BD Biosciences-CLONTECH 的Great EscAPeTM Reporter System 均能采用荧光分析和化学发光分析方法检测到超低浓度的SEAP。
2. 5 荧光素酶(luciferase ,luc) 报告基因[ 9 ,10 ]
该酶克隆于北美洲萤火虫(Photinus pyralis) 的荧光素酶基因,它能催化甲虫的荧光素的氧化性羧化作用,发射出光子,能被光度计或闪烁计数器捕获定量。由于荧光素酶分析具有快速、方便,更具有很好的浓度线性范围(具有7～8 个数量级的线性范围) ,而被广泛应用。另外由于荧光素酶能在合成时与蛋白产生融合蛋白,以及该酶的检测灵敏度达10 - 20mol ,且该酶的半衰期很短,在评价基因的表达物的诱导效应的瞬间分析中具有较好的效果。在既往的检测中,要求光密度计具有一自动探头,能在加底物的0. 3 秒内测量出光子发射的峰值。现在的方法已经有了很大的改进, 在化学反应中通过降低反馈抑制( reducing feedback inhibition) 而使信号更加稳定,使其检测可以用液闪法或光照度计法进行检测。如PerkinElmer Life Sciences 的Wallac GeneLux kit ,应用dithiothreitol ,pyrophosphate ,及牛血清白蛋白来稳定光子的发射; Roche Molecular Biochemicals 的Luciferase Gene Assay 使用辅酶A 使光子发射稳定数分钟;Roche的Luciferase Assay with Constant Light Signal 中使用AMP 使信号半衰期长达3h ; Packard BioScience 公司的LucLite.and LucLite Plus ,Constant2QuantaTM reporter gene assays 称因“使用长命型光信号”(10ng-lived“glow”-type signal) ,而使其半衰期长达5h。值得一提的是Promega 公司的Dual-Luciferase . Reporter Assay System 将萤火虫荧光素酶与海三色堇( seapansy ,Renilla reniformis) 荧光素酶的优点结合起来,建立了单管双报告酶的分析体系,使其具有内参照系统而检测基因的表达。Renilla 荧光素酶的结构与萤火虫荧光素酶的结构完全不同,可使用coelenterazine 为底物, 使用Promega 公司提供的stop &Glo.Reagent 能使萤火虫荧光素酶失活而使Renilla 荧光素酶激活:AppliedBiosystems 的Tropix .Oual -Light.assay 提供使荧光素酶与β-gal 在同一管内相继检测的方法,且在检测方法简单、快速的同时并未使方法的灵敏度和测定范围值下降。
2. 6 绿荧光蛋白( green fluorescent proteins , GFP) 报告基因[ 11～13 ]
该基因来源于西北太平洋海域的水母(Aequorea victoria) 。该蛋白在紫外光下发射荧光,而可以被多种方法检测。该报告基因检测不需要底物,基因产物-绿荧光蛋白在加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶均不能使它灭活。另外,该蛋白的可用荧光显微镜或荧光激活的细胞分类系统( FACS) 进行检测,该报告基因还有一重要优点即能在活细胞条件下观测,而且能进行细胞内的定位分析。因为野生型的GFP 无放大作用,故比荧光素酶的灵敏度低。目前已有很多公司将野生型的GFP 进行基因工程改造,使其荧光更亮、能发出不同颜色的荧光以及可表达在细胞的不同部位。GFP 基因还能在转基因小鼠中以无害的形式整合于小鼠的DNA 中。当然有些种类的GFP 因对细胞有毒,而使其在细胞中不稳定。Stratagene 公司从海三色堇(R. reniformis) 提取GFP 的cDNA 建立了低毒性的人性重组GFP ,使其能在细胞中因其低毒性而稳定表达。CPG公司的AFP2TagTM vectors 是一种能与插入的目的基因产生融合蛋白的标记载体,它能发出蓝、绿色荧光。红色转换型GFP 与蓝色荧光蛋白是GFP 的突变体,它们均能在不同的激发光下发出不同颜色的荧光,因此而能被分别检测。由于绿色和蓝色荧光蛋白的光谱不相重叠,所以AFP-Tag 载体能被单独或一起使用。由于该荧光蛋白具有稳定的自身荧光现象,所以可在活细胞或固定后的细胞中进行观察,且可在细菌或真核细胞中都能表达。Qbiogene 公司的SuperGloTM GFP 与Super-Glo BFP 证明提高激发光的峰值,使其发射光谱用荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer ,FRET) 进行活细胞内的荧光的观察。BD Biosciences2CLONTECH 公司的构建了一种报告基因质粒(Living ColorsTM Fluorescent Timer) ,在插入的目的启动子随着时间而失活时,其颜色也由绿色变为红色。为了提高检测的灵敏度,Heim 等[ 14 ] 人将GFP 发光结构中的Set65 用Thr 替代,Phe64 用Leu 替代,使荧光的强度提高了35 倍,而且在激发后的16～24h 仍可稳定地检测到荧光,此外,还用人源性较好的密码子替代野生型中的密码子,而大大提高了在哺乳细胞中的兼容性,这些改变使得GFP 的检测灵敏度提高了很多,Clontech 公司的p EGFP 系列就是该类报告基因质粒。该公司的另外一个试剂盒Living ColorsTM HcRed采用从reef coral Heteractis crispa 提取的有色蛋白基因,并进行突变改装,做为报告基因,该基因编码的有色蛋白为非荧光蛋白,不需要发色辅助物质,且发光光谱峰值在618nm ,为红光,极易与背景光分开,而能被流式细胞仪高效率分辩。
3.报告基因的特殊应用
随着报告基因的快速发展,某些特殊用途的报告基因质粒载体已经被很多的生物技术公司进行类商品化的生产,而很方便地用来研究。如Stratagene 公司的PathDetect cis-reporter plasmids 该报告基因带有一启动子和增强子,能启动荧光素酶或GFP 的表达,常用于研究基因的顺式转录元件的研究。同样, BD Biosciences2CLONTECH 开发了MereuryTM Pathway Profiling Systems 它还能帮助研究者研究与信号转导如,炎症、细胞分化、PKC 与钙通道信号及压力反应。每一系统都包含有一系列的含有不同启动子的质粒如p53 反应元件,糖皮质激素反应元件,或E2FDNA 结合元件及SEAP、d2EGFP 或荧光素酶报告基因。Stratagene 公司的PathDetect trans-reporting systems 可以让研究者研究目的基因是否会影响如c-Jun 的N末端激酶(JNK) 、有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK) 、c-AMP 依赖的激酶( PKA) 、或p38 激酶的活化通路。该系统通路特异的反式报告质粒能编码如CAT、β-gal ,SEAP ,luciferase ,或hrGFP。Thermo Labsystems 公司以Gene Therapy Systems(GTS) 为基础开发的PNA 依赖的基因化学( PNA-dependem gene chemistry) 被认为是一种新的、独特的报告基因。PNA(pep-de nucleic acids) 为一类寡核苷酸类似物,能序列特异性地与靶DNA 杂交结合,如质粒。同时还能与其配体、荧光素、抗体结合,使与其结合的DNA 一起形成复合物。于是,目的基因即可被插入pGeneGrip TM vector 上的多克隆位点,而修饰成报告基因,并连接上被荧光染料罗丹明( rhodamine) 、荧光素、生物素或马来酰亚胺(maleimide) 标记的PNAs。因为连上的标记为荧光基团或功能性多肽,所以对研究DNA 的分布及功能来说,会变得很简单了。表达GFP、β-gal 、荧光素酶及SEAP 报告基因的载体以及用PNAs 标记的连接物均已商品化。Heim 报道[ 15 ]将EGFP 报告基因与表达单链抗体可变区(single-chainantibody variable fragment , scFv) 的基因相连结, 构建出可与HBsAg 特异反应的绿荧光抗体,可直接用于HBsAg 的检测。另外,Yang 等报道,将EGFP 基因结合到特异性蛋白质表达基因上,而表达融合蛋白,将此融合蛋白做为蛋白激酶的底物,通过水解底物后荧光颜色及强度的改变的检测,能提高蛋白激酶反应的灵敏度。
报告基因技术随着时间的推移,而被广泛应用到高产量药物的筛选、基因治疗实验、以及生物传感器的构建以及基因的调控与功能的研究中。而其报告基因的种类及检测的方法、灵敏度、特异性均会得到很大的发展。
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