蛋白质组学在药物毒理中的应用
来源： 浏览量：1642 更新日期：2010年1月7日
国外医学药学分册 2003 年8 月 第30 卷第4 期 238
王全军综述 廖明阳审校 (军事医学科学院毒物药物研究所, 北京 100850)
摘要: 蛋白质是生命活动的主要承担者,一切生命活动无不与蛋白质有关。蛋白质组学是研究细胞内蛋白质组成及其活动规律,对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。本文重点介绍了蛋白质组学的理论基础和研究技术,在药物毒理研究中临床前、临床中发现毒性标志物以预测或早期发现药物毒性及毒性作用机制的研究,并简单阐述了蛋白质组学技术的发展。
随着人类基因组计划的完成和相关基因组技术的发展,许多基因组学的技术都被用于研究药物潜在的作用靶点和疾病诊断的标志物。最终能够实现病人根据自身的基因组成进行个体化诊断。现在,人们清楚地认识到基因的改变将最终表现为蛋白质和蛋白质功能的改变。因此,蛋白质组学的研究越来越受到重视。
蛋白质组(proteome) 是指一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。蛋白质组学是研究细胞内蛋白质组成及其活动规律,对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究[1 ] 。蛋白质组技术用于分离和鉴定有机体特定功能的蛋白质。蛋白质组学技术最大的优点是可以直接收集病人在特定的生理条件下分泌到体液中的蛋白质进行检验,而不需要直接采集组织标本。传统方法上,毒理学家通常结合病理和生化技术,利用动物实验来评价一个新药的安全性。现在毒理学家利用蛋白质组学技术可以在细胞水平上通过鉴定新蛋白或蛋白质谱的变化来解释一些毒理现象,在实验室和临床中对人和动物进行药物安全性观察。目前,随着药物研究开发进度的加快,需要借助一些新技术和方法来理解一些药物毒理现象和临床前试验预测。运用蛋白质组技术鉴定与药物有关的蛋白质能够反映药物的毒性,可以找到新的生物标志物。与目前所应用标志物相比,这些生物标志物将更灵敏、预测性更强。因此,更适合应用于新药的评价。
1 蛋白质组学的理论基础和研究技术
在不同的细胞周期、分化阶段、生理状况及环境条件下,机体蛋白质组都会发生变化。但是从mRNA 表达水平上并不能预测蛋白质的表达水平,因为翻译与转录丰度间无显著相关性。而且体内蛋白质的合成存在动态修饰和加工,通常不由基因决定。许多细胞的功能调节在mRNA 水平上是难以发现的,因为这些调节发生在蛋白质的结构域上。所以,只有蛋白质组学的研究才有可能为细胞或组织状态提供精确的分子描述。
蛋白质组学的研究,主要包括两个方面的工作:(1)“组成蛋白质组”研究,即建立一个细胞、一个组织或一个机体在生理条件下的蛋白质二维电泳表达图谱[2 ] ; (2)“功能蛋白质组”研究,目的是了解在各种条件下的蛋白质组的变化,从中总结出生命活动规律。在药物研究领域中主要侧重于功能蛋白质组的研究,通过比较药物处理前后蛋白质表达的变化提示药物的作用。蛋白质组学研究的手段很多,目前,在蛋白质分离方面,主要是双向凝胶电泳〔two-dimensional ( 2D ) polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) , 2DE〕。22DE 技术可以把蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上很好地分开,并可对分离出的蛋白斑点进行定量和定性分析。蛋白质的生物合成
常存在翻译后修饰和加工,如肽链的磷酸化等,该过程对蛋白质的正常生理功能是必需的,并且往往与疾病的发生有关。在22DE 图谱中常可发现蛋白拖拽现象,这就很可能是一种蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。在蛋白质鉴定方面,随着各种新的质谱技术的发展,蛋白质组学已经从蛋白质鉴定深入到高级结构研究,以及各种蛋白之间的相互作用的研究[3 ] 。利用生物信息学对蛋白质组的各种数据进行分析和处理,也是蛋白质组学研究的重要内容。
2 毒理蛋白质组学的应用
蛋白质组学在药物研究中的应用被称为“药物蛋白质组学”(pharmacoproteomics) ,在药物毒理上的应用也就被称为“毒理蛋白组学”(toxicoproteomics) 。毒理蛋白质组学的应用主要分为两大部分: (1) 在临床前、临床中发现毒性标志物(单一物质或表达谱)以预测或早期发现药物毒性; (2) 药物毒理机制的研究。与传统方法相结合,蛋白质组学在鉴定药物毒理机制上具有广阔的应用前景,能更准确地预测药物在人体中所发生的毒性[4 ] 。在机制研究的基础上,蛋白质组学更适用于药物毒性筛选和预测。确立毒性作用和蛋白质标志物之间的关系就意味着可以利用这些标志物进行新化合物的毒性筛选。应用灵敏的蛋白质组学技术可以在比传统方法(如组织病理和临床化学) 剂量更低、时间更短的情况下鉴定出毒性作用。这样就可以对研究的早期预测药物潜在的毒性作用和对先导化合物进行毒性排序,从而有效地节省大量时间和经费。目前,毒理蛋白质组学主要应用于肝脏、肾脏和致癌性等方面的毒性预测。
2. 1 肝脏毒性的预测
肝脏是人体物质代谢和解毒的重要场所,因此也是一个容易发生毒性的器官。在药物研究和开发中,常常因为一些肝脏毒性的药物不良反应(ADR)致使许多候选药物失败[5 ] 。因此,在新药评价时都把肝功能作为检测指标。Anderson 等[6 ]研究了不同药物作用于动物肝脏后的蛋白质表达谱,从而建立了肝脏毒性蛋白质组库。利用这个肝脏毒性蛋白质组库,在一定程度上可以鉴定、区分和预测药物的肝脏毒性,因为鉴定出的特定蛋白质与毒性损伤机制具有一定的关系。Arce 等[7 ]利用蛋白质组学技术研究了降糖药SDZOGU6 9 3 的毒理机制。研究发现SDZOGU693 能够诱导肝细胞肥大,线粒体蛋白质显著增加,并鉴定出29 个与肝功能改变有关的蛋白质,结果表明SDZOGU693 可以诱导线粒体增生,它们都与SDZOGU693 的肝脏毒性有关。Cunningham等[8 ]研究H1 受体拮抗剂马来酸美吡拉敏(mepyra2mine , pyrilamine) 及其类似物非基因毒致癌剂美沙吡林(methapyrilene) 的毒性时发现,虽然它们的结构相似,但在肝脏中却具有完全不同的蛋白质表达图谱,与马来酸美吡拉敏相比,美沙吡林使肝脏蛋白质表达发生了更大的改变。结果说明蛋白质组学在药物先导物的筛选中具有重要的作用。
蛋白质数据库的建立有助于预测肝脏毒性。通过与数据库中一些工具药所产生的蛋白质图谱相比,根据它们之间的相关性就可以预测一个新药的潜在肝脏毒性。如果相关性较强,则就应该在肝脏毒性方面比较注意这个药物的使用。但数据库是一定的工具药物在一定的剂量和时间点的情况下建立的。因此,在应用数据库时要注意保持相应的一致性。通过建立信息丰富的数据库将会提高蛋白质组学对毒性的预测性。
2. 2 肾脏毒性的预测
肾脏也是机体中容易中毒的一个器官。利用蛋白质组学技术可以研究与肾脏损伤有关的蛋白质表达谱的变化。抗生素庆大霉素是氨基糖苷类中比较典型的肾脏毒性物质,对其在剂量依赖性、时间依赖性情况下肾脏毒性和停药恢复状况的研究已经比较清楚。常规生化检验证明其在高剂量下具有肾脏毒性,组织病理检验表明,在恢复阶段肾细胞有再生现象。Kennedy 等[9 ]利用蛋白质组学技术研究了庆大霉素处理组蛋白质所发生的特异性的变化,结果得到了一些新的蛋白质标志物,并且这些标志物能够反映庆大霉素一些新的毒理机制。有趣的是,这个蛋白质标志物在常规病理方法不能检测到的剂量和时间下也有表达,并且在处理组恢复阶段其表达水平又恢复到与对照组一致。因此,利用蛋白质组学可以在细胞未受到明显损伤的情况下监测肾脏毒性的发生。
免疫抑制剂环孢素A 有肾脏毒性,在临床上的应用一直受到限制。Steiner 等[10 ]利用蛋白质组学技术分析了环孢素A 处理后鼠的肾脏,鉴别出一种新的钙结合蛋白(calbindin2D) ,这个钙结合蛋白可能作为肾脏毒性的一个新的标志物。Aicher 等[11 ]研究发现,在人和鼠肾脏毒性中都发现了这个钙结合蛋白,但是在猴和狗中却没有发现。因此,研究表明蛋白质组学技术在了解毒理机制上具有重要意义。
2. 3 致癌性的预测
评价一个新药的致癌性是一个比较费时间和耗经费的过程。因此,在新药开发中任何快速的分析方法都会受到欢迎。Bergman 等[12 ]在癌细胞上鉴定出发生变化的蛋白质,也许这些蛋白质与致癌剂的处理有关系,能够用来预测早期的肿瘤发生。M°ller等[13 ]利用蛋白质组学技术研究了柔红霉素处理胰癌细胞,结果发现柔红霉素的致癌性与P21 蛋白质的表达有关。Chevalier 等[14 ] 利用非基因毒致癌剂萘酚平(nafenopin) 和表皮生长因子( EGF) 来处理鼠原代肝细胞。结果两者都能诱导DNA 合成,EGF 通过其受体作用,而萘酚平则通过过氧化物酶体增殖受体,两种处理组细胞蛋白质组所发生的变化是不同的,结果表明蛋白质组可以用来区分不同的促有丝分裂途径。M°ller 等[15 ]利用蛋白质组和RNA 技术联合分析细胞毒素柔红霉素处理胰管细胞系发现,柔红霉素处理所引起变化的蛋白质所对应的mRNA 并没有发生改变,表明处理组蛋白质的改变发生在转录后。这就更说明了在蛋白质水平上阐明复杂的生理过程的必要性。
蛋白质组学在药物毒理中能够得到更好的应用,首先需要建立大量的药物作用在生物模型上所产生的蛋白质组库。蛋白质组图谱库的建立必须包含大量的工具药物在一定剂量依赖性和时间依赖性下所建立的数据库,其中包括常见药物的毒性机制和特异性的毒性机制。但更应该考虑蛋白质组图谱库与药物作用机制的一致性。蛋白质组图谱库的建立方便了新候选药物与工具药物蛋白质组的比较,早期毒性标志物的发现可以提示进一步的研究和利用这些毒性特性来优化先导化合物。
由临床前生物模型中得到的毒理蛋白质组也有助于对临床试验中典型的组织病理结果的解释。在动物实验中得到的与毒理机制相关的蛋白质组有助于临床医生监测药物毒性。但也需要鉴定出与人毒性有关的生物标志物,作为动物模型的替代,可以在服用已知毒性的药物的病人身上采集样品进行分离人特异性的标志物。标志物的出现可以作为早期停止用药的标志。这样就可以在出现明显临床症状之前鉴定出这些生物标志物,从而在组织受到破坏之前就可以进行一系列的预防,避免疾病的进一步发展。生物标志物也可以作为鉴别病人发生不良反应的因素之一。这样,这些病人在预选之后,可以接受更适合的治疗。但也应该认识到生物标志物的鉴定是一个十分复杂的过程,利用蛋白质组学技术得到的不同处理、不同标本之间表达差异的蛋白质仅仅是生物标志物鉴定的一个开始,以后还要利用已经具有的研究背景知识和分子生物学技术对这些蛋白质在功能和生物学特性上进行系列的鉴定,才有可能真正成为一些药物毒理的标志物。
3 蛋白质组学技术的发展
2DE 技术提供了一个研究蛋白质组高通量的途径,其替代技术也在发展之中。一些蛋白质芯片(protein chip) 技术已经进入应用阶段[16 ] 。例如,抗体芯片(antibody2based chips) 可用于鉴定和分离一些已知的蛋白质。但是,蛋白质都要进行修饰以方便鉴别。现在可以利用双抗体法,一种抗体用于标记蛋白,另一种抗体用于检测。这一技术的优点是其高通量性和可以应用于常规实验,缺点是必须分离到蛋白质并且要找到相应的抗体。最新的技术之一是同位素编码亲和标记(iso-tope-coded affinity tag , ICAT) ) 方法,它可以在分离前标记蛋白[17 ] 。在该方法中,实验组和对照组样品的蛋白质组用化学性质相同而同位素不同的两种巯基反应试剂在其还原型半胱氨酸侧链上分别标记,一种碳骨架上含有通常的氢原子(称为d0) ,另一种含重同位素试剂(称为d8 ) ,即氢原子被替换为氘原子。这一对含d0 和d8 ICAT 试剂标记的肽在化学上是相同的,根据稳定同位素稀释原理,它们可以互相作为蛋白质定量的内标物。因此,通过测量这对同位素标记的肽段的相对信号强弱来测定在两个生物样品中的每种蛋白质的相对含量。协同质谱(MS) 进行分析,这样就可以得到相应的蛋白质。因为ICAT方法可以把标记、分离和多肽的分析组合成一个自动化过程,因此每天能够分析数千个样品。
4 结语
利用蛋白质组学技术将能够发现大量与药物毒理研究有关的标志物及疾病诊断的标志物,并且能够利用所鉴定的标志物预测药物毒性。也能够发现大量新的蛋白质和药物靶点,从而加快药物研究开发的进程[18 ,19 ] 。目前,蛋白质组学还处在一个发展阶段,特别是在药物毒理的应用方面,它所面临的最大挑战是不能够检测表达丰度很低的蛋白质,但其也许是功能很强的蛋白;电泳胶上的斑点很大一部分为多个蛋白质的组成,这在蛋白质鉴定上也有一定的难度;很难分离跨膜蛋白质;对于所分离和鉴定出大量蛋白质数据的分析,并根据这些信息从多维度综合分析蛋白质的功能也有一定的难度。但随着2DE 技术和MS 技术灵敏度的提高,蛋白质组生物信息分析和蛋白质组替代技术的发展,将能够更好地揭示蛋白质的功能。蛋白质组学与基因组学及代谢组学的联合研究,将能够增强了解药物毒性的作用机制及药物毒性预测的能力。因此,蛋白质组学技术在药物研究中将具有非常广阔的应用前景。
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