【摘要】猪广泛用于生理学和实验外科研究。随着小型猪的培育成功,在药理学和毒理学领域的应用明显增加,在毒理学研究中,已成为非啮齿类动物中的一个新的选择。为推动国内小型猪在毒理学研究方面的应用,特综述小型猪在一般毒理学、皮肤毒理学、生殖毒理学和药物代谢方面的研究情况和小型猪应用的局限性。
由于解剖和生理学特性与人类相似,猪已成为生物医学研究中独特的模型动物。在心血管系统、消化系统、泌尿系统、皮肤、整形外科以及异种脏器移植研究中广泛应用。自从1949 年第一个小型猪——明尼苏达小型猪(Minnesota minipig) 培育成功后,猪作为实验动物开始引入药理和毒理学研究领域。目前,国际上已培育出许多遗传稳定的小型猪品系,随着在毒理学研究中应用数量的增加,背景资料也愈加丰富。
1 一般毒理学研究
对新的化学药物的一般毒理学研究,国际性的指导原则要求选用两种动物,一种为啮齿类,另一种为非啮齿类。狗和猴是非啮齿类中的常用动物。由于猪在代谢和一些药物的代谢动力学方面比狗和猴更接近人类,因此,很多学者认为小型猪可作为非啮齿类的又一个选择。
Brandt 等[1 ] 对15 358 只SPF 哥廷根小型猪(Gêttingen minipig) 的体重遗传表型进行了分析,结果表明,经30 余年的人工培育,哥廷根小型猪的遗传变异很小。Jones 等[2 ] 在电生理和病理学方面探讨了乌克坦微型猪(Yucatan micropig) 作为常规毒理学和毒性机理研究的非啮齿类动物的可行性。结果表明,该种小型猪能够接受心电图、定量脑电图和视网膜电流图等多项电生理指标的检测,临床化学、尿常规及病理检查(除了可见鼻炎,将干扰吸入性药物的毒性实验外) 也未见对毒理研究有干扰的异常,被认为是毒理学研究中器官系统功能测定的良好模型动物。
在毒理学研究中,最常用的非啮齿类动物是Beagle 犬,犬对非甾体类抗炎药物十分敏感,通常在低于人用治疗剂量时就能引发胃肠道损伤、糜烂或溃疡,从而限制了给药剂量,也常常掩盖了其他副作用。而小型猪却对胃肠道的副作用有较强的抵抗力,可以顺利地完成此类药物的毒性实验。另一个例子是拟交感神经药物和降压药物,拟交感神经药一般在ED50剂量时,在犬和小型猪都可出现心律增加的药理作用,但是犬往往伴有心肌坏死,而猪却从未观察到形态损伤。猪在这方面的反应虽然不如犬敏感,但是这可能恰恰与人相似,因为至今尚无人类应用治疗剂量的拟交感神经药物发生心肌坏死的报道[3 ] 。
Herman 等[4 ] 比较研究了敏乐定引起小型猪和Beagle 犬的心肌损伤,结果敏乐定在小型猪体内引起的毒性反应明显较轻,病变也与犬不完全相同。Ikeda 等[5 ] 比较了放射标记的丙烯酰胺在小型猪和Beagle 犬体内的分布和代谢,结果表明该药物在两种动物体内的组织分布和代谢排出方式基本一致,仅犬对药物在胃肠道的吸收方面表现得更加全面和迅速。
2 皮肤毒理研究
药物毒理研究的给药途径需要与临床应用尽可能一致,经皮给药的药物毒理实验不但要考虑吸收后对全身器官系统的影响,而且要考虑对皮肤局部的影响。在经皮给药的毒理实验中,对非啮齿类动物的选择比较复杂。兔在这方面的应用历史最长,但是由于兔的生理学特性与人差异较大,使之应用范围受到限制。而Beagle 犬的皮肤被毛浓密且有色素沉着不利于实验观察。现在国际上,哥廷根小型猪的白色系及无毛的乌克坦微型猪在皮肤毒理学研究中应用广泛。
猪的皮肤大体解剖上与人类十分相似,包括被毛稀疏、皮肤表面纵横交错的特征性细纹、不同种类的皮肤或有或无色素沉着、不同区域的皮肤结构有一定变化。组织学上既有相同之处,也有不同。不同区域的皮肤厚度均有较大变化,人类大约在50～120 mm 之间,猪在70～140 mm 之间。猪的表皮层和人类皮肤一样具有很精细的结构,仅角质层更厚和致密;细胞更新率几乎完全相同(大约28 d) ;均可见树突状细胞,如,色素细胞、朗格尔汉斯细胞。真皮均富含弹性纤维,但猪的血管分布比人少,而血管收缩能力却更完善,在猪体温调节中起到重要作用;人类大部分皮肤分布的汗腺为外分泌型,受神经支配,主要分泌水样汗液,而在猪的外分泌型汗腺仅见于口鼻部,主要分布的为顶浆分泌型“汗腺”,受激素调节,仅在青春期变得活跃,分泌的为一种奶样物质,对于体温调节并不重要;猪的体温调节不靠分泌汗液,而靠血管收缩P扩张、外源性水或泥浆降温。
许多文章探讨了不同种类动物皮肤对化学物质的通透性,由于在这些研究中所采用的技术方法的不同而难于比较。Bartek 等[6 ] 利用14 C 标记的一系列化学物质在大鼠、家兔、小型猪和人的在体经皮通透性进行了比较,结果表明,大鼠和家兔的皮肤通透性明显高于人类和小型猪,而用小型猪经皮吸收试验可很好地预期人类经皮吸收药物的结果。Reifenrath 等[7 ] 证实9 种化学物质在猪和人类透皮吸收方面具有很好的相关性,而无毛犬的相似性却不好。Wester 等[8 ] 证实雄性激素在恒河猴与人类之间的透皮吸收方面有很好的相似性,该作者在总结一些雄性激素透皮吸收的资料后认为:皮肤的通透性,兔>大鼠> 豚鼠> 猪> 恒河猴> 人类,认为恒河猴与猪是人类透皮吸收的最好模型。Mannisto 等[9 ] 利用小鼠、豚鼠及小型猪观察了蒽三酚及其102酰基类似物对皮肤的急性刺激性及迟发刺激性,结果达到最大刺激性的时间分别为小鼠耳24 h、豚鼠背48 h、小型猪背部1 周,并指出小型猪是人类皮肤的良好模型。JP - 8 是美国军用飞机的主要燃料,Kanikkannan 等[10 ] 比较了它在Yucatan 小型猪和人体皮肤的通透性,并观察了对猪皮肤 的刺激性,他认为猪耳部皮肤可很好地预测化学物质在人类皮肤的通透性。硫化芥和芥子气是潜在的化学发疱战剂,曾利用小型猪进行了大量的皮肤毒理研究,并取得了与人类皮肤损伤和吸收十分相似的结果,但是,Chilcott[11 ] 的体外研究认为,用猪耳部皮肤进行硫化芥吸收防护研究效果不理想。
3 生殖毒理研究
猪动情期促性腺激素和性腺类固醇的血浆浓度变化与人类月经周期的变化十分相似,在滤泡发展期雌激素分泌量逐渐增加,这对通过GnRH 介导释放促性腺激素、FSH 和LH ,从而启动排卵十分重要。排卵后形成黄体,血清孕酮含量增加。LH 是主要的催乳激素(luteotropin) ,而不像在啮齿类中那样催乳素(prolactin) 起到主要的催乳激素的作用。但是,在整个怀孕期间需要卵巢中黄体的出现来维持妊娠,而在人类和灵长类动物中胎盘很早就代替了黄体来负责怀孕期的激素控制。
小型猪有一个融合的上皮绒毛膜型胎盘,而人类和猴为浸血绒毛膜型胎盘。但是,在怀孕期间由于母亲和胎儿之间的屏障上皮内和上皮下的毛细血管的发展而使母亲和胎儿血液的距离缩短。在胚胎发育过程中,最关键的体节形成的出现时间,小型猪为怀孕后14～15 d ,而人类为20～21 d ,但是此时的胎儿体长却完全一致(3 mm) 。对致畸物质的敏感性,通常与这一阶段密切相关。然而,在给予致畸物的时间、器官发生期引起畸形的类型之间通常没有一个精确的关系。胚胎形成期和胎儿期的比率在人类为1∶4 ,小型猪为1∶3 ,大鼠为3∶1。现已发现猪对许多致人类胎儿畸形的物质具有敏感性, 如, 酞胺哌啶酮( thalidomide ) 、羟基脲(hydroxyurea) 、氨喋呤(aminopterin) 、乙嘧啶(pyrimethamine) 、乙醇(ethanol) 、维甲酸(tretinoin) 等。Hayama 等[12 ] 应用哥廷根小型猪研究了乙嘧啶的致畸作用,结果在怀孕母猪的器官形成期给予乙嘧啶可引起上腭裂和其他出生缺陷,也有新生仔猪的功能性缺陷——后肢瘫痪。Zomborszky Kovacs[13 ] 等研究了烟曲霉素B(1) 对猪胚胎的有害作用。
4 药物代谢及毒性机理研究
非生命物质在其体内代谢机制的异同,是选择与人类代谢机制相关试验模型的关键,物种间变异最重要的来源之一是肝脏CYP 酶(细胞色素P450)的含量和活性的差异。在人类,CYP3A4 是已知主要药物的代谢酶,占肝脏总CYP 的60 % ,最近的研究表明,大鼠、小鼠和兔的主要CYP 同构体含量与人类差异很大,这反映在典型的人类CYP3A4 底物硝苯吡啶,在大鼠是以CYP2C 亚科的不同同构体代谢。在大多数实验动物,最著名的形式是CYP2B亚科,而在人类样本中它的含量极少。Monshouwer 等以人类CYP3A4 的cDNA 探针与猪肝脏mRNA 进行的交叉杂交证明在猪的肝脏存在CYP3A 样物质,而Anzenbacher 等[14 ] 的研究进一步证明了在小型猪肝脏微粒体中存在CYP3A 活性,而且在含量与活性上与人类的酶有可比性。猪肾近曲小管上皮细胞系LLC2PK1 和猪肝细胞体外培养在毒理机制研究中应用广泛, 例,Kiyomiya 等[15 ] 观察了庆大霉素在LLC2PK细胞刷状缘和基底膜两侧分别应用的毒性反应。结果表明,当氨基糖苷类抗生素作用于基底膜和刷状缘时,表现出对肾近曲小管上皮细胞的不同影响,而且细胞吸收类型也不相同。Ulrichova 等[16 ] 利用人类和猪的肝细胞研究了四苯并菲啶碱(QBA)细胞毒性的分子机制,在药物处理后以MTT检验、乳酸脱氢酶释放和细胞内谷胱甘肽水平来检测细胞损伤情况。结果表明,人类和猪的肝细胞对应用QBA 的毒性反应方面未见差别。此外,Luo 等[17 ] 利用成年猪视网膜及幼年和成年大鼠视网膜比较研究了兴奋毒性在视网膜中央区细胞(RGC) 坏死中的作用。结果,兴奋毒性所致体外培养RGC 的坏死在动物种类之间和不同发育阶段之间发生很大变化,认为该实验系统提供了一个青光眼样神经元坏死的药理和毒理研究的简单模型。Ambalavanan 等[18 ] 研究了香烟提取物对培养血管平滑肌细胞生长的影响。他们分离新生猪颈动脉、脾动脉、主动脉和肺动脉血管平滑肌细胞体外培养,以细胞增值、生存能力、凋亡和培养液硝酸盐、亚硝酸盐含量进行了评价。
5 小型猪实验应用的局限性
尽管小型猪作为人类模型动物的优越性已成为人们的共识,但是,在实验中的应用量并不是很大,在毒理学研究中也远未取代犬的位置,这里一方面有Beagle 犬在毒理学研究中有长期应用的历史,遗传稳定,背景资料丰富的原因,另一方面,小型猪应用还有一定的局限性。首先是小型猪实验操作不便。小型猪在实验中远不像Beagle 犬那样配合,在给药、采血等常规操作时,实验者体力消耗较大。反复的经静脉给药困难。另外,小型猪皮下脂肪较厚,给解剖、取材带来不便。其次是小型猪体型仍然较大。对于药理和毒理学研究,体重的增加就意味着实验中的给药量要增加,对于贵重药物,在长期毒性试验中,实验经费将要大幅度地提高。
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