摘要：本文扼要比较了各国新药遗传毒性测试方案，介绍了目前新药遗传毒性测试方法的研究现状和今后有发展潜力的几种高通量筛选方法。
关键词：药物 ； 安全性评价 ； 遗传毒性
中图分类号：R99 文献标识码：A
遗传毒性试验作为新药安全性评价的一个内容始于70年代后期，实施20多年来，对于保障人类健康、促进医药工业的发展无疑都发挥了重要作用。近十几年来随着相关领域特别是分子生物学的发展和人们对遗传毒性认识的深入，遗传毒性测试评价方法也正在经历巨大的变化。本文试图扼要概述目前该领域的研究动向，分析今后可能的发展趋势。
1 现行各国遗传毒性试验的比较
由于没有单独一个遗传毒性试验方法可检测所有的遗传毒性终点，因此，药物和其它化学物遗传毒性的评价大多均采用组合试验的方法。现行各国制订的遗传毒性试验方案从选择的试验项目来看比较近似(见表1), 但具体方案有所不同[1，2]。
表1 一些国家遗传毒性试验的项目
微生物回复突变试验 ＋ ＋ ＋ ＋
哺乳动物培养细胞染色体畸变试验 ＋ ＋ ＋ ＋
啮齿动物微核试验 ＋ ＋ ＋ ＋
(+)必需做 (±)视情况而定 (-)未要求
日本的评价方案中,微生物回复突变试验既可采用沙门氏菌也可采用大肠杆菌致突变试验，而欧共体和中国都只规定了沙门氏菌致突变试验;欧共体和中国还提出了备选试验(哺乳动物细胞或酵母菌基因突变试验),而日本和加拿大则无。
英国的评价方案分3个阶段。第1阶段采用细菌基因突变试验和体外细胞染色体畸变试验。如果该受试物接触人群广泛或持久而难以避免，同时如果有1个或1个以上试验呈阳性结果则进入第2阶段：加骨髓细胞遗传学试验。如果体外试验呈阳性而在骨髓细胞遗传学试验结果为阴性，则需加体内试验，最常采用为体内－体外UDS试验。第3阶段重点评价对生殖细胞遗传毒性的危害。
美国FDA尽管未要求特殊的组合试验，但新药评审时仍需提供有关研究资料。据对美国14家主要药物公司的调查，其采用的试验项目情况见表[2]。
表2 美国14家制药公司采用的试验项目调查结果
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试 验 |
公司数 |
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微生物致突变 |
14 |
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沙门氏菌 |
14 |
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大肠杆菌 |
10 |
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DNA损伤修复 |
8 |
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体外UDS |
7 |
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碱性洗脱 |
1 |
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哺乳动物细胞致突变 |
12 |
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CHO hgprt |
7 |
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V79 hgprt |
2 |
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小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk |
3 |
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CHO AS52 GPT |
1 |
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体外染色体畸变 |
13 |
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CHO/V79 |
9 |
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人淋巴细胞 |
4 |
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大鼠淋巴细胞 |
2 |
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体内染色体畸变 |
5 |
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体内微核试验 |
10 |
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体外SCE |
1 |
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BALB/C 3T3转化 |
1 |
德国采用的标准化组合试验包括5个试验，德国联邦药物和医疗设备研究所对1990～1997年期间登记的335种新药的遗传毒性测试结果见表[3]。
表3 德国1990～1997年335新药遗传毒性测试结果
细菌回复突变试验 298 23 7.7
小鼠淋巴瘤细胞tk试验 104 28 26.9
hprt试验 162 6 3.7
体外染色体畸变试验 266 77 28.9
体内骨髓细胞遗传学试验 283 19 6.7
另外，ICH(1997)提出标准组合试验[3]，即细菌基因突变试验(采用Ames试验或大肠杆菌回复突变试验)，哺乳动物细胞(CHO,CHL或V79)体外染色体损伤试验或小鼠淋巴瘤细胞tk试验和啮齿动物造血细胞体内染色体损伤试验(染色体畸变或微核试验)。其中供选择或已接受的哺乳动物细胞基因突变试验为CHO 试验、V79/(HPRT)试验、CHO AS52/GPT试验、人体类淋巴细胞tk试验。
2 遗传毒性试验方法的研究现状
一个试验组合的基本要求是能对DNA损伤和损伤固定的危害性作出鉴定。问题是体外遗传毒性试验可能鉴定一种化合物的遗传毒性潜力，但不能鉴定真正的危害性。通过添加体内试验可能更接近遗传毒性危害性鉴定的目标。然而，采用极端高剂量和一次给药的体内细胞遗传学试验可能并不充分。为此，ICH要求进行额外试验以确保危害性鉴定是充分可靠的。这些试验包括对DNA加合物、DNA链断裂和DNA修复或重组的测定。然而，即使这些试验导致遗传毒性物质明确的鉴定，也不能对人的危险度进行定量，既不能评价高剂量效应外推到低剂量时的效应，也不能确定从实验动物外推到人危险度时的不肯定因素。现行常用试验方法的优缺点比较见表4[4] 。
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表4 现行常用试验方法的优缺点
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试验系统 |
优 点 |
缺 点 |
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细菌回复突变 |
遗传毒性试验的“奠基石”
有效（相对快速的测试）
经济
所用菌株对某些特异类型突变敏感
已经几次修订并充分评价
已有大量测试结果的数据
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不能检测哺乳动物细胞染色体断裂，即诱发染色体突变
有毒物质常常产生小菌落的本底，可能误认为阳性结果 |
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小鼠淋巴瘤细胞试验 |
可检测基因和染色体突变
对啮齿动物致癌性有很高的预测性
试验已被充分特征
比体外染色体畸变试验更有效、更经济
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需仔细依附一个特定的方案
比细菌回复突变试验昂贵和耗时
只能间接的评价染色体畸变 |
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体外染色体畸变 |
可直接直观的观察染色体事件，得到有关细胞周期效应的信息
与小鼠淋巴瘤细胞试验比较，其与某些实验室的专家评价结果更一致
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需专门的知识
较小鼠淋巴瘤细胞试验主观
如果未在暴露受试物后的适当时间采集细胞可能得到假阴性结果 |
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体内染色体畸变 |
可直接直观的观察染色体事件，得到有关细胞周期效应的信息
历史上第一个发展起来的遗传毒理学试验
可得到有关体内代谢效应的信息
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需特殊的专门知识
较微核试验主观
较微核试验昂贵和耗时
采样时间对确保可靠结果非常关键 |
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微核试验 |
比体内染色体畸变试验更快捷、价廉，较少主观性
与体内染色体畸变试验相比需更少的专门知识
可得到有关体内代谢效应的信息 |
不能像体外染色体畸变试验那样直观的反映染色体的所有效应
仅有较少的细胞周期效应信息 |
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对遗传毒性危险度评价来说，研究潜在致突变剂对生殖细胞的效应是必需的。但目前试验方案中均未包括此类试验，主要是现有试验方法太复杂、费力、费钱。如小鼠特异位点试验，每次试验需数千只动物，一般实验室难以实施。
近年来，遗传毒性试验的方法学研究主要从两方面着手。
2.1 现行试验方法的标准化 对现行试验方法进行评价、修订，加以完善，特别在标准化方面，如对微核试验、生殖细胞突变试验、Ames试验、染色体畸变试验等开展国际性或区域性(如欧共体)协作研究，以评价实验室间和实验室内的误差，规范操作程序。国际环境诱变剂学会组织专家分别于1993和1999年召开遗传毒性实验程序国际研讨会,对常用毒性实验方法进行了两次较全面的修订[6，7]。一些机构对试验指南进行了修订，如OECD推荐的Ames试验的菌株为TA1535、TA1537或TA97a、TA98、TA100、大肠杆菌WP2uvA或WP2uvA(pKM101)TA102;鉴于Gen-Tox评述了600余种化学物的L5178Y小鼠淋巴瘤细胞突变试验结果，发现对啮齿动物致癌性化学物的预测性超过90％，OECD和ICH等结构将小鼠淋巴瘤细胞突变试验列入其指南中[4，5]。
2.2建立了某些新的试验方法 近几年发展了许多新方法[6～14]：①体内或体外的单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)，可检测不同细胞 (如皮肤角质细胞、鼻呼吸和嗅觉细胞、精母细胞和卵母细胞等)少量细胞的DNA链断裂，方法快速简便。②荧光原位杂交(FISH)和引物原位DNA合成法(PRINS)，可检测特异染色体、着丝粒和端粒以及感兴趣的某个区段的染色体畸变，包括易位、数目异常。FISH技术可用于检测生殖细胞的非整倍体。今后彗星试验和FISH技术通过特异的DNA探针可联合用于检测选择性序列、区段和染色体的DNA损伤。③反向限制位点突变(iRSM)分析试验，该方法是基于致突变作用可使一个突变位点转化成另一限制性位点，从而通过检测某些由于DNA序列改变导致新的限制性酶位点而快速筛检遗传毒性。④转基因动物突变检测系统，可在整体状态下检测基因突变，比较不同组织(包括生殖腺)的突变率，确定靶器官，对诱发的遗传改变作精确分析等。不同基因的转基因小鼠和Knockout小鼠的应用也为阐明致突变和致癌的分子机理提供了可能。这些方法的一个重要优点是灵敏度高，可观察低剂量下的遗传毒性，从而更符合人体的实际情况。⑤转基因细胞试验系统，将代谢酶基因转入哺乳动物细胞，如MCL细胞系表达5种主要类型的cyp450酶，可用于测试基因突变、微核等遗传毒性终点；GPTAS52哺乳动物致突变系统，包括了细菌的GPT基因，可用于测试基因突变。⑥转基因细菌，将N－乙酰转移酶、硝基还原酶、细胞色素p450等参与致突变物活化的基因导入细菌或酵母致突变实验菌株，构成细菌或酵母突变测试系统。特别是导入人体的代谢酶基因模拟人体的代谢情况。
上述新方法吸收了分子生物学等相关学科的理论和技术，与原实验方法相比有明显的长处，特别是在遗传毒性机理研究上。但这些新方法要纳入药物安全性评价还需进一步做验证实验。
3 发展趋势
随着新药研究方法学与技术的飞速发展，今后药物设计者与毒理学家的关系将更加密切，毒理学将更早阶段的介入新药研制过程中。由于往往可能要求毒理学家对候选药物的毒性作出快速的判断，甚至是对成批药物进行筛选鉴定，因此，今后的一个主要发展趋势是发展高通量的测试方法(high throughput testing)。下面简要介绍有发展潜力的主要方法。
3.1 新的Ames试验(AmesII试验) [17] 1994年Ames建立了一套6个鼠伤寒沙门氏菌株(TA7001－TA7006)，可鉴定6种碱基对置换突变，每一菌株携带一专一的组氨酸生物合成操纵子的错义突变。除组氨酸突变外，这些菌株还携带了不同的可增强靶组氨酸突变的附加特性，包括具有SOS可诱导的mucAB系统的R因子pKM101、uvrB切除修复组分的缺失、rfa突变。这些菌株的自发回变率相当低(约10个回复突变子/皿)，检测各种致突变物的敏感性相当于TA100、TA102和TA104菌株。试验在96或384微孔玻板上进行，在培养基中加入pH指示剂。当回复突变的菌株生长时，培养基pH改变，pH指示剂由红变黄，通过分光光度计测定。该试验在不需序列分析情况下即可鉴定突变谱。
3.2 哺乳动物细胞的高通量测试 已有几种手段可筛选哺乳动物细胞的DNA损伤。
3.2.1 ML-1人骨髓白血病细胞系统[18] 已知哺乳动物DNA损伤可诱导与细胞生长停滞和凋亡有关的基因。抑癌基因p53和凋亡抑制基因bcl-2两者之间可调节显性癌基因的效应(功能拮抗)。显性癌基因对抗性或敏感性的效应取决于p53和bcl-2两者之间的平衡，而DNA损伤的后果是p53表达激活和bcl-2表达失活，从而引起细胞生长的停滞和凋亡的诱发。ML－1人骨髓白血病细胞暴露于DNA损伤剂可诱导各种基因表达产物的剧烈改变，包括p53(野生型)、mcll(涉及细胞分化的bcl-2家族基因)、G1细胞期生长阻滞(p53突变的后果)、DNA损伤可诱导基因(如GADP45)表达增加,也可导致bcl-2(抗凋亡基因)表达降低。这些改变通常作为早期事件出现，如mcll mRNA水平在暴露于DNA损伤剂4 h内就迅速增加，但持续短暂，在24 h内又恢复到基线水平。
3.2.2 遗传报告基因检测法[19] 利用细胞对DNA损伤剂反应的转录原理可以用于DNA损伤的检测。通常以融合基因的应用为基础，以报告基因的表达改变为终点，分析受试物对相关基因表达的诱导作用。转染的融合基因通常由外源性化学物反应性蛋白的结合部位或增强子序列、启动子序列以及指导报告分子合成的序列(报告基因的编码区)相连而成。将嵌合的报告基因构建体导入适当细胞后，用受试物处理，通过测定细胞或培养液中报告基因的水平或活性作出评价。如有两种CAT实验，采用人结肠癌的细胞系(RKO)DNA损伤实验和人肝细胞系(HepG2)的细胞应激实验。也可将报告基因导入细菌构成测试系统，如将荧光酶基因(Lux gene)引入TA98和TA100菌株中，使两菌株获得发光性状，可用发光强度反映回复突变的细菌数。
3.3.3 基因芯片技术[20] 该技术可以用于细胞、细菌、动物和人体组织测试，既可测试基因表达的改变，也可检测基因突变。它不仅可以准确地确定突变位点和突变类型，更重要的是它的快速高效是目前其他方法所无法比拟的，它可以同时检测多个基因乃至整个基因组的所有突变，是传统的突变检测技术的一大突破。此外，计算机毒理学(computational toxicology)、专家系统(expert system approach)和结构活性关系分析(QSAR system approach)也有巨大的发展潜力。
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