组织工程讲座
来源： 浏览量：870 更新日期：2010年1月4日
组织工程(Tissue Engineering)是近年来正在兴起的一门新学科，属于生物高技术范畴。
组织工程一词最早是在1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出，1988年正式定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。
组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以以及组织工程的临床应用。目前临床上常用的组织修复途径大致有3种：即自体组织移植、异体组织移植或应用人工代用品。这三种方法都分别存在不足，如免疫排斥反应及供体不足等。组织工程的发展将从根本上解决组织和器官缺损所致的功能障碍或丧失治疗的问题。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，这与传统的二维结构（如细胞培养）有着本质的区别，其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代；用最少的组织细胞通过在体外培养扩增后，进行大块组织缺损的修复；可按组织器官缺损情况任意塑形，达到完美的形态修复。
作为一种新兴产业，组织工程具有良好的发展前景和广阔的应用市场，其商业利润非常诱人。所以一些研究机构与大公司联手进行开发研究，仅1997年直接用于组织工程研发的费用就达5亿多美元，并以每年22%的速度增长。相信随着科学技术的发展，组织工程即将或正在成为治疗组织、器官衰竭的有效疗法和辅助手段。
第一课 组织工程研究内容
组织工程（Tissue Engineering）是近年来正在兴起的一门新兴学科，组织工程一词最早是由美国国家科学基金会1987年正式提出和确定的。它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科学。
组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。共基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损病分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。
在此，生物相容性好、可被人体降解吸收的组织工程支架材料称为细胞外基质（ECM），其功能是为细胞提供生存空间，使细胞获足够的营养物质，进行气体交换，并使细胞按预制形态的三维支架生长。在细胞和生物材料的复合体植入机体病损部位后，生物支架被降解吸收，但种植的细胞继续增殖繁殖，形成新的具有原来特殊功能和形态的相应组织器官。
组织工程是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上的又一新的里程碑，它标志着医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代。同时，组织工程学作为一门多学科交叉的边缘学科，将带动和促进相关高技术领域的交叉、渗透和发展，并由此演化出新的高技术产业。组织工程将是21世纪具有巨大潜能的高技术产业，必将产生巨大的社会和经济效益。
组织工程的概念一提出，就受到各国学者的广泛关注，美国在1988年就以基金和资助的形式建立了一系列实验室。目前，美国已有相当数量的研究机构（包括NASA、DOE、NIH等），许多相关大学（包括MIT、HMS、GIT、UCSD、UMASTFFU）都参与了组织工程的研究。同时，我国的许多学者以敏锐的科研意识与思维，不约而同掀起了一股组织工程热，目前已在软骨、骨、肌腱、血管、皮肤、角膜等领域取得了可喜的进展。组织工程研究包括以前四个方面。
一、种子细胞研究
种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自体、同种异体、异种组织细胞等。自体组织细胞应为首选。由于组织工程细胞培养多需要高浓度的细胞接种，自体组织细胞存在着数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。现在的研究多集中于以下的几个方面：
1．载体等技术用于细胞的快速增殖。
2．干细胞工程 干细胞工程是利用现代生物医学和组织工程技术，通过对间充质干细胞、胚胎干细胞、血管-造血干细胞、神经干细胞和皮肤、肌肉等前体细胞，进行体外分离纯化、定向诱导分化、转基因及核移植、大量扩增和整合构建，在体外重构人骨、软骨、肌肉、肌腱、瓣膜、脂肪、真皮、基质、神经、血管、皮肤、角膜以及造血和免疫等组织。它作为组织工程的“上游”研究，对未来的组织器官修复和替代具有极其重要的作用和深远的影响。在组织器官的细胞来源、细胞扩增与定向诱导分化、重构组织器官的种类、重构效率、重构组织器官的植入等方面，与传统的组织工程相比均存在着明显的不同和优势。其中骨髓基质干细胞是一研究热点。
3．采用各种生长因子和断粒酶调节与延缓细胞的老化。
4．采用各种方法（包括自身转化、化学、物理、病毒等方法）诱导细胞发生转化，使其倍增时间减少，永生化或生命期延长，也是一个努力方向。
但是要建立适于组织工程需要的种子细胞，需要解决以下问题：①增加细胞的增殖能力；②延长细胞的生命期；③提高细胞的分泌能力；④优选不同组织来源的同一功能的最佳细胞；⑤建立标准细胞系，使研究工作有更好的可比性和科学性；⑥同种异体与异种移植的免疫学；⑦细胞与人工细胞外基质的相互作用及影响因素。
采用同种异体细胞来源，在目前仅对少数组织细胞（如软骨组织的组织工程培养）有望获得成功。
二、细胞外基质的研究
细胞外基质（extracelluarmatrix,ECM）包括均质状态的基质（蛋白多糖、糖蛋白）和细丝状的胶原纤维。ECM是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。
理想的ECM应具有以下特点：①生物相容性好，在体内不引起炎症反应和毒性反应；②有可吸收性，能彻底地被自身组织所取代；③有可塑性，可塑为任意的三维结构，植入后在体内仍可保持特定形状；④表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长；⑤降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。
目前组织工程所应用的材料很多，主要分为以下几类：
1．天然ECM早期人们采用胶原制作人工皮和血管的模型，由于胶原存在着力学性质差，不稳定，在体内被吸收过快等缺点，限制了它的应用。现在主要研究集中于采用脱细胞技术制造天然的ECM，其优点在于可以作为组织充填物而长期存在，有较好的组织相容性和亲和性，完整的天然ECM内可能存在着某些复合生长因子，可诱导调节细胞的生长、繁殖、分化等。
2．人工的ECM目前研究最多订有聚乳酸（polylacticacidPLA）、聚羟基乙酸（polyglycolicacidPGA）、两者的共聚物（PGA-PLA）、聚ρ-羟基丁酯（PHB）；聚乳酸-已内酯的共聚物（PLC）、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐等。这些材料的共同特点是：具有生物相容性及可塑性，在体内可逐步分解为小分子如乳酸、羟基乙酸等，目前研究主要集中于人工材料的改性、复合某些生长因子等。尽管这些聚合物植入体内会出现或多或少炎症反应，但有望通过进一步的纯化而减弱或消失。
3．天然高分子同合成高分子的复全物 如胶原-PCA的复合特等。
4．有机材料同无机材料的复合物
如羟基磷灰石-甲壳素的复合物，羟基磷灰石-PLA的复合物等。
三、组织器官的构建
组织和器官的构建因应用于不同的方面，方法也不相同。但其本质都是把种子细胞与支架材料结合得到设计的组织或器官。在此，仅以组织工程骨的构建和血管的构建为例。
1．骨组织构建
构建组织工程骨的方式有几种：①支架材料与成骨细胞；②支架材料与生长因子；③支架材料与成骨细胞加生长因子。
生长因子通过调节细胞增殖、分化过程并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程，因此，在骨组织工程中有广泛的应用前景。常用的生长因子有：成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF-ρ）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍化生长因子（PDGF）、骨形态发生蛋白（BMP）等。它们不仅可单独作用，相互之间也存在着密切的关系，可复合使用。目前国外重点研究的项目之一，就是计算机辅助设计并复合生长因子的组织工程生物仿真下颌骨支架。有人采用rhBMP-胶原和珊瑚羟基磷灰石（CHA）复骨诱导性的骨移植、修复大鼠颅骨缺损，证实了复合人工骨具有良好的骨诱导性和骨传导性，可早期与宿主骨结合，并促进宿主骨长大及新骨形成。用rhBMP-胶原和珊瑚复合人工骨修复兔下颌骨缺损，结果显示：
2个月时，复合人工骨修复缺捐赠 的交果优于单纯珊瑚3个月时，与自体骨移植的修复交果无明显差异。
目前，用组织工程骨修复骨缺损的研究，已从取材、体外培养、细胞到支架材料复合体形成等都得到了成功。有人用自体骨髓、珊瑚和rhBMP-2复合物修复兔下颌骨缺损，结果表明：术后3个月，单独珊瑚组及空白对照组缺损未完全修复；珊瑚-骨髓组和珊瑚-rhBMP-2组及单独骨髓组已基本修复了缺损；而骨髓、珊瑚和rhBMP-2复合物组在2个月时缺损即可得到修复。我们用骨基质成骨细胞与松质骨基质复合物自体移植修理工复颅骨缺损的动物实验，也取得了满意的治疗效果。
带血管蒂的骨组织工程是将骨细胞种植于预制带管蒂的生物支架材料上，将它作为一种细胞传送装置。我们将一定形状的thBMP-2、胶原、珊瑚复合物植入狗髂骨区预制骨组织瓣，3个月时，复合物已转变成血管化骨组织。
组织工程骨的构建又可以分为体内构建和体外构建两种形式，体内构建是将成骨细胞-支架复合物植入体内，修复骨缺损。体外构建则是通过体外组织培养的方法应用水降解支架材料，接种成骨细胞，构建骨组织。体外构建虽然具有一些在体内构建难以实现的优点，但是在传统的静态培养条件下不能建造出厚度大于0.7cm的骨组织。生物反应器和灌注培养系统的先后出现，改善了细胞、组织在体外培养的条件，有助于模拟体内环境、获得营养、排除代谢产物和物质交换，和促进组织工程产品实现商品化。
2．组织工程血管构建
构建组织工程血管有两种：①用正常动脉壁细胞与细胞外基质重建血管；②用正常血管壁细胞、细胞外基质和可降解材料构建血管。
血管壁中切取弹性基膜，并在其上培养鼠动脉平滑肌细胞；或用工型胶原制备基质材料与各型血管壁细胞成分合成血管模型。首先将平滑肌细胞与成纤维细胞分别培养形成细胞层，将成纤细胞层脱水去细胞形成内膜（IM），再将内膜绕在中轴上，外裹平滑肌细胞和成纤细胞层，经过体外8周长时间成熟后，内壁注入内皮细胞使之内皮化。各项检测及动物实验，结果从机械强度、血液相容性、可缝合性等方面效果满意。但整个制备过程需长时间的成熟期，约需3个月作用，其后期效果有待进一步观察。
由于生物基质材料机械性能差，随着可降解材料的研究深入，使其成为组织工程再造血管的一大热点材料，常用的有聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PLLA）等。Kim在PGA网格中，通过静态、动态、旋转接种三种方法种植平滑肌细胞，培养血管平滑肌组织。N iklason将平滑肌细胞种植于管状PGA材料中，在模拟血管搏动的环境中培养8周，使之形成成熟的平滑肌组织，内膜层接种内皮细胞后，再在相同的环境中培养8周，形成的组织工程血管可耐受2000mmHg压力，缝合强度达90g，胶原含量达50%。
血管模型对特定药物具有收缩反应，平滑肌细胞还表现出分化特性。
组织工程再造血管具有高度生物相容性、可塑性、异物反应小、无致血栓生成、无感染等特点，并且随着组织的长大，最终可成为完全说明书义上的自体血管。这一研究将给心血管疾病的治疗，乃至组织器官的移植与再造带来曙光。
四、组织工程临床应用
组织工程中临床应用是在组织构建完成了动物试验之后，在人体上的应用，这也是组织工程的最后一步。目前，组织工程的研究只有活性皮肤达到了这一步。
第二课 组织工程支架材料
可以看到，用于组织工程的生物材料—组织工程支架材料是组织工程的基础，是组织工程领域中的一个不可或缺的环节，因此组织工程支架材料自然形成了组织工程的一大分支。
近年来，组织工程支架材料这一领域的研究极为活跃，人们不仅在组织工程的最早产品人工皮肤领域进行了更为完善听研究和开发，同时，在诸如人工骨、软骨、神经、血管材料等各系统，都进行了大量的研究和控索。
组织工程支架材料是根据材料用于不同人体组织，并根据具体替代组织具备的功能所设计的。组织工程支架材料包括：骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官，如肝、脾、肾、膀胱等的组织支架材料。下面分别对这些组织工程支架材料加以叙述。
一、骨组织工程支架材料
1、人工骨的支架材料功能
人的骨头在人体中起一支撑人体重量，维持人体力学平衡的功能，因此，人工骨的组织工程支架材料必须具备以下两个功能。
（1） 有一定机械强度以支撑组织的高强度材料，以保证材料植入人体后，有支撑体的重量，不改变骨骼形状。
（2） 有一定生物活性可诱导细胞生长、分化，并可被人体降解吸收。
在组织工程出现以前的第一种功能的材料为非降解性材料，仅起到支撑固定的作用。存在的一个问题是：在骨头愈合后，必须进行第二次手术取出这种材料。
第二种功能的材料主要是给细胞提供三维生长空间，其本身具有生活性，可诱导细胞分化生长和血管的长入，以形成活的骨组织，使其具有人骨的功能和作用。
以上两面三刀个对骨支架材料要求的条件可以归结为：组织工程支架材料是具有一定强度并具有生物活性的可降解材料。
2、人工骨支架材料研究进展
人工骨支架材料可分为两类，即生物降解和非生物降解型。
早期的人工骨支架材料都是非生物降解型的，这类材料有：高聚物（碳素纤维，涤纶，特氟隆），金属材料（不锈钢，钴基合金，钛合金），生物惰性陶瓷（氧化铝，氧化锌，碳化硅），生物活性陶瓷（生物玻璃，羟基磷灰石，磷酸钙）等。
这些材料的特点是机械强度高（耐磨、耐疲功、不变形等，生物惰性（耐酸碱、耐老化、不降解）。但存在二次手术问题，因此人们开始研究使用可生物降解并具有生物活性的材料，这类材料有纤维蛋白凝胶、胶原凝胶、聚乳酸、聚醇酸及其共聚体、聚乳酸和聚羟基酸类、琼脂糖、壳聚糖和透明质酸等多糖类。
目前研究和使用的骨组织支架材料是降解材料或降解和非降解材料的结合。
二、神经组织工程支架材料
理想的人工神经是一种特定的三维结构支架的神经导管，可接纳再生轴突长入，对轴突起机械引导作用，雪旺细胞支架内有序地分布，分泌NTFs等发挥神经营养作用，并表达CAM、分泌ECM，支持引导轴突出再生。
以往用于桥接神经缺损的神经套管材料有硅胶管、聚四氟乙烯、聚交酯、壳聚糖等。如以硅胶管为外支架，管内平行放置8根尼龙钱作为内支架的“生物性人工神经移植体”。
目前用于人工神经导管研究的可降解吸收材料有聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）及它们的共聚物等。也有用聚丙烯腈（PAN）和聚氯乙烯（PVC）的共聚物制作神经导管，内壁具有半透膜性质，仅能允许分子量小于50KD的物质通过，使再生轴突能从导管外获取营养物质和生长因子，并避免纤维疤痕组织的侵入。但因其不能降解，在完成引导再生轴突通过神经缺损段之后，仍将长期留存于体内，有可能对神经造成卡压。
戴传昌、曹谊林制备了聚羟基乙酸（PGA）纤维支架，其上接种体外培养扩增的雪旺细胞（SC）形成一种组织工程化周围神经桥接物。沈尊理等则利用生物可吸收纤维PDS作为胶原神经导管内部的三维支架结构，种植雪旺细胞，形成一种人工神经。叶震海、顾立强利用自行研制的PLA管作为外围的神经导管，以生物可吸收缝线PGA纤维作为内部纵行三维支架结构，种植SC；发现SC可以贴附于PLA管壁、PGA纤维生长，引导再生轴突生长向前。
选择适宜的生物材料，使SC与生物材料粘附，加入生长因子，对细胞外基质与可降解吸收生物材料经体外培养，在体内预制呈类似神经样SC基膜管结构（众多纵行中空管奖结构），使人工神经血管化或预制带血管蒂，并保证SC存活、增殖并有活性，这此将成为今后的研究热点。
神经修复的组织工程支架材料一类是取自于自体的神经、骨骼肌、血管、膜管的天然活性材料，另一类是非生物活性材料，例如脱钙骨管、尼龙纤维管、硅胶管、聚氨酯等。神经支架材料的功能有两种。
（1） 必须为神经的恢复提供所需的三维空间，即要保证神经导管具有合适的强度、硬度和弹性，使神经具有再生的通道。
（2） 要保证其有理想的双层结构：外层提供必要的强度，为毛细血管和纤维组织长入提供营养的大孔结构；内层则可起到防止结缔组织长入而起屏障作用的紧密结构。因此，神经修复所用支架材料一般为：外层是强度大、降解速率慢的可降解材料，内层为具细胸生长活性的降解材料。用于神经修复的内层材料多为胶原和多糖。目前研究和使用的多为胶原和聚乳酸的杂化材料。
三、血管组织工程支架材料
血管支架材料类似于神经支架材料，其结构上也分为双层，但内层不同于神经支架材料的是其为与血液相容性好的生物活性材料，该类材料要求不仅具有生物活性，同时还要具有抗凝血和抗容血作用。这类材料一般为经过表面修饰的降解材料，外层材料必须为保证内层材料细胞生长提供一定的支撑强度、抗拉强度和韧性。
1、血管支架材料的类型
最早的外层材料一般为尼龙、聚酯等无纺布或无纺网等。目前，该类材料应用较多的为胶原或明胶蛋白包埋的或表面处理的可降解材料的无纺网，例如：聚乳酸、聚羟基酸和多肽等的无纺布或无纺网等。
2、血管支架材料的研究进展
20世纪50年代问世的Dacron是最早应用的人工血管，由于它对凝血系统有激活作用而只能对大口径血管有较短的替代作用。以后又开发利用四氟乙烯（ＰＴＦＥ）、聚氨基甲酸乙酯（Ｐoroussegmented Polyurethane）、膨体聚四氟乙烯（e-ＰＴＦＥ）等，并通过多种方法改变材料的物理性状、表面特点，以达到血管植入的要求。
（1）人工材料上打孔，使之形成多微孔结构，一者提高材料的顺应性，与自体血管弹性相匹配，二者使用周围毛细血管内皮细胸通过微孔长入内膜层，覆盖内表面。Ａlexander.w.Clowes证实６０pePTFE移植后形成内皮细胞层，主要依靠周围毛细血管经微孔处长大，而不是吻合口两端内皮细胞的延伸生长，（两端的延伸仅约２cm），并指出完整的内膜层会减少平滑肌的过度增和。Ｍatsuda采用激光在聚氨基甲酸乙酯膜上打孔，促进内皮细胞的爬行覆疬。
（2） 采用各种可降解涂层以减轻血小板及血细胞的粘集，并希望随着涂层逐步降解，内皮细胸逐步爬行覆盖。Ｓatoshiniu等采用多聚环氧化合物做交联剂，在人工血管上形成明胶－肝素涂层抑制血小板的聚集、纤维素的形成，同时利于吻合口内膜的长入。Ｈimyukinkito在血管假体内表面涂布硫酸软骨素（ＣＳ）及透明质酸（ＨＡ），外表面涂以明胶层，以达到内表面抗血小板、血细胞吸附，外表面吸引周围组织长入的目的。ＡrumaＮ在内膜剥脱的血管周围放置浸有内皮细胞的明胶海绵，利于内皮细胞的迁移及旁分泌等作用减少内膜的增生。
（3） 人工血管内皮化 由于内皮细胞在抗血栓形成、抑制血小板聚集、分泌血管活性因子等方面的重要作用，人们很早就设想在人工血管内表面形成内皮细胞的衬里，以达到模拟自体管的目的。宿主内皮细胞由吻合口向人工血管内迁徙仅限于吻合口周２cm，而毛细血管通过管壁的长入、循环内皮在人工血管表面的沉积这两种途径的原因、机制效果不清，有待进一步研究。于是将新鲜获取或体外培养的内皮细胞址接种植于人工血管的内表面，成为首选的努力方向。
四、肌腱组织工程支架材料
1、肌腱与韧带支架材料的功能
肌腱与韧带组织中的功能细胞分别是肌腱细胞和成纤维细胞，二者在组织来源上均属成纤维细胞型，但肌腱细胞分泌Ｉ型胶原，而成纤维细胞分泌Ｉ、Ⅱ型胶原。因此，肌腱组织支架材料必须可降解，但一定要是降解时间较长的材料。
2、肌腱与韧带支架材料类型
20世纪70年代肌腱支架材料一般使用硅橡胶、尼龙聚酯、碳纤维等，目前使用的多是聚酯聚二氧杂环烷等。
五、皮肤组织工程支架材料
人工皮肤材料在生物医学工程材料中已有论述，在此不再赘述。
六、 角膜组织工程支架材料
人工角膜材料要求透明，吸水，有一定的机械强度，屈光性好等特点，同时，要求可降解。以前常用的材料为HAMA、PMMA，近来来，多采用胶原和聚醇酸等材料。
七、 肝、胰、肾、泌尿系统组织工程支架材料
肝、胰、肾、泌尿系统使用的组织工程支架材料多为可降解材料，目前这方面研究和使用的材料，主要以天然蛋白、多糖与合成高聚物杂化的可降解材料。例如：用于肝组织工程支架的血纤维和聚乳酸，用于泌尿系统的聚乙醇酸等。
第三课 用于组织工程的新肽生物材料支架
细胞外基质为构成组织提供了支架。组织的3D结构是由细胞-基质和细胞-细胞间的相互作用决定的。过去的20年已被证明了许多基质支架蛋白和它们的构成性的生物活性黏附基序[1]。发育生物学的研究增加了我们对这些基序的时空表达方面的知识—生物活性黏附或抗黏附作用在组织发育过程中短暂发生或在器官的整个生命过程中永久存在以确保成体组织的结构。许多在发育阶段负责组织构成的分子信号在成体动物体内是不存在的。因此，在胞外基质中组织构成的信号存在或不存在决定组织的再生能力。这些分子信号也负责例如轴突再生的特定细胞功能。对组织修复的需要已经刺激能用于人造组织和诸如生物传感器的可移植装置的生物材料支架的发展。
理想的候选生物材料支架应严格符合以下标准: (1)有易于设计和修饰的基本单元；(2)该材料的生物降解速度可调控；(3)没有细胞毒性；(4)具有能特异促进或抑制细胞-材料相互作用的特性；(5)能引发的免疫反应和炎症最小；(6)材料的生产、纯化和处理是容易的并可升级和(7)有与水溶液和生理条件的化学相容性。与这些条件中的任何一项不符将给该候选生物材料的潜在应用带来限制。
从蛛丝到胞外基质蛋白来的材料给生物材料支架提供了良好的样本。自然产生的生物材料支架（如胶原蛋白）能经化学修饰而授予合意的特性。但是，自然界仍然是最完美的材料工程师，而对可塑性的需求又鼓动人类材料工程师。生物相容性的合成材料正越来越多用作生物材料支架。自我组装的多肽、有机多聚物、无机材料或混合的同聚物已用于制造人工的生物材料支架。最近在组织工程方面的文献报道强调了控制生物材料几何特性的重要性。为了出现合意的细胞分化，就必须存在具有促进细胞-基质和细胞-细胞间几何结构形成的物理特性的基质。从基质传导来的机械力的几何分布影响细胞的形状，甚至决定细胞是死还是活。显然，这些现象与基质蛋白本身的类型无关。
自然来源的材料
基于细胞的治疗方法是治疗许多疾病的另一种替代治疗方法。在一些病例中，疾病对小分子药物具有抵抗性。几种自然来源的动物产物如基于胶原蛋白的生物支架，它们的衍生物和生物相容性同聚物已用于细胞吸附的支架。
但是，对所有动物来源的生物材料来说，一个潜在的问题是他们能携带危险的病原菌。传播性海绵状脑病(TSE)是能够跨物种传播的最令人担心的病原菌[6]。伴随脘病毒跨物种传播到人类的脘病毒介导的海绵状脑病的出现，更加重了这种担心。尽管用极端的pH或温度可以摧毁许多致病因子，但是脘病毒（TSE的病因）对化学或物理降解具有极端的抵抗力。因此，现在正在进行巨大的努力来加强动物来源产品的TSE检验及创造人工重组胶原蛋白。其他病毒也可能在动物来源的生物材料中作为病原体而携带。
合成的肽生物材料支架
所有合成的生物材料有一个优点即它们能将携带生物源性的病原体或污染物的危险降低到最低程度。在控制药物释放、组织修复和组织工程等方面合成的生物材料存在一些吸引人的特性。最近发展的合成生物材料展示了体内生物兼容性的可喜进步。合成生物材料的最大优点是他们能被设计成符合特定的需要的东西。通过插入能促进细胞吸附的生物活性基序的例子表明了这样设计的可塑性：（例如，细胞黏附基序精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸(RGD)是整合素即细胞黏附受体的配体）。在某些情况下，合成的生物材料由自然产生的诸如氨基酸等的小生物分子的多聚物组成。合成的生物材料的碱性单元表现出良好的生理兼容性和最小的细胞毒性，并且来自生物分子的生物材料的降解产物能插入至新合成的生物分子或在宿主体内被代谢掉。其他合成的生物材料由体内不存在的诸如陶瓷的物质分子组成。这些材料（例如骨组织替代材料）展示出如高抗拉性等另人满意的特性。
最近发现一类由自发自我组装的寡肽组成的生物材料[9–11]。这些生物材料支架的成分是自我互补的两性寡肽组成，它们有规则的重复单位：带正电的氨基酸残基（赖氨酸或精氨酸）和带负电的氨基酸残基（天冬氨酸或谷氨酸）被亲水性残基（丙氨酸或亮氨酸）分开。自我互补的两性寡肽包含50%的带电残基，并且以交替的离子亲水性和不带电的憎水性氨基酸的周期重复为特征。这些例子包括RAD16-I（以单个字母代替氨基酸，其序列为AcN-RADARADARADARADA-CNH2）和RAD16-II（其序列为AcN-RARADADARARADADA-CNH2）。尽管RAD16-I 和 RAD16-II长度相同，氨基酸数目相同，但是RAD16-I有(RADA)n的空间模式（其中n代表重复数），而RAD16-II只有两个(RARADADA)n的空间模式。图1显示了来自RAD16-II的有代表性的肉眼可见的基质支架（摘自文献10）。等浮力（在溶液中自由漂浮，既不下沉也不升至表面）的基质支架能被编织成有相对粘稠的各种各样的几何形式，要么象带子(Fig. 1a)，要么象线条(Fig. 1b)，要么成片状(Fig. 1c)。肽和盐浓度，连同处理仪器的维数，决定宏观基质的几何结构和维数。圆性二色性分光镜显示基于RAD, ELK, 和EAK的具有如前描述的典型周期性的肽链在水溶液中展示强的β片层二级结构。其他几个实验室也描述了由具有β片层二级结构的其他自我组装的寡肽形成的生物材料。因此，按照这些简单的氨基酸构成和空间序列排列的规则形成的自我互补的两性肽链战时了两个不同的极性和非极性表面。
RAD、 ELK 和 EAK 多肽的规则β片层二级结构与基于蛋白螺旋参数的Chou-Fasman统计结果相反。谷氨酸、亮氨酸和赖氨酸在Chou-Fasman模型中均具有a-螺旋倾向。Hecht及其同事对此矛盾作出了完美的解释[12]。在一个迷人的研究中，他们发现了决定二级结构的局部和非局部的分子内影响的竞争结果。采用自我组装的合成蛋白的家族来检测这些竞争的影响。决定二级结构的局部影响包括氨基酸的内在螺旋特性（正如Chou-Fasman模型预测的一样）。非局部的影响是被在肽序列中的氨基酸的周期性和位置排列例证的--周期性和位置排列决定所有被测试的合成肽的二级结构。因此，非局部效应超过局部效应。周期性和氨基酸的位置排列的相对优势说明已观察到周期性交替两性多肽的β片层结构倾向，而不是预测的a螺旋结构。值得注意的是局部和非局部对二级结构的影响是分子内的而不是分子间的。这个结果是采用CD证明相对浓度不依赖于EAK16-II的规则β片层结构而获得。更近一点的是，Broome 和 Hecht采用一个包含250 514个自然产生的蛋白序列的数据库对包含周期性的交替极性和非极性氨基酸的序列作了统计搜索。他们发现交替极性和非极性氨基酸的序列在自然发生蛋白中相当稀少。他们的发现表明对由交替极性和非极性氨基酸的序列导致的严重的寡聚化倾向存在很强的选择压力。
有兴趣地是，来自两性多肽的生物材料基质的形成高条件依赖性的。诸如RAD16 和EAK16的两性多肽在无盐的水溶液中溶解度是毫摩尔级。但是，当这种肽暴露在生理介质或盐溶液中时，两性多肽形成水凝胶基质。毫摩尔级的单价阳离子负责整齐基质的形成。整齐的生物材料基质是水浓度>99%的水凝胶。与在单价阳离子存在的情况下自发形成的整齐的生物材料基质相反的是，毫摩尔级的二价阳离子用EAK16及其相关肽形成高度不规则的材料。这个盐触发的分子开关是如何工作的？其中一个解释是盐促进个体肽的触发排列，而基质的形成是临近多肽的带正负电的残基的静电相互作用的结果。可是，增加盐浓度并不破坏基质的稳定性，这表明了一个替代机制。如果这些多肽是互补的，水溶液中的单体多肽可能折叠而形成分子内的静电相互作用。加盐可能破坏分子内的静电相互作用，从而多肽采用一种构成形式来迎合临近多肽间的分子间的增水作用。
对这个模型的支持来自对肽链长度和脂肪族残基的憎水性程度的研究。含丙氨酸的两性肽链（如EAK16）至少需要16肽来形成盐诱导的稳定基质。相反含亮氨酸的两性肽链（如ELK8）由18肽形成盐诱导的稳定基质。这些结构表明增加脂肪族残基的憎水性导致基质的形成。第三个分级模型包括前两个模型的特性。临近多肽的带电残基间的分子间的静电相互作用可能在分子间憎水性相互作用的形成后导致基质的稳定。RAD16多肽及它们的潜在的分子间的相互作用如图2所示。这些基质形成和稳定的替代模型迄须实验的直接证明。自我组装材料也能从包含合成的氨基酸（自然产生的蛋白中不存在）的多肽组装--这些分子被称作多肽模拟物。处理条件（ pH、温度和盐浓度）能够改变从而影响自我组装的多肽模拟物的几何构象。
这些肽基质对什么有效？基于RAD的两性多肽的序列与细胞黏附受体整合素配体RGD有相似性。一些胞外基质蛋白包含结合在整合素异构体的RAD序列。第一个被测试的假想是细胞是否在整合素依赖模式的肽基质上吸附和生长。细胞吸附在基于EAK和 RAD基质上是整合素依赖模式，并且基于EAK和 RAD的基质支持细胞吸附和生长。RAD序列能结合在某种细胞黏附受体的整合素上，而EAK却不能。此外，高浓度的RGD肽对EAK和 RAD基质的吸附和生长没有作用，从而证明基于整合素的黏附对吸附于这些肽基质的细胞吸附并不是必须。EAK和 RAD肽基质支架支持各种哺乳动物和禽类原代和转变的组织培养细胞的细胞吸附。
再近一些，已证明了在肽基质支架上的原代和培养的神经元细胞的吸附、分化、神经丝的长出和功能性突触的形成[10,11]。这样充满神经元的基质支架能够在不同的环境间运输。这对用于移植的神经元/基质的潜在应用是一个重要的问题。
神经丝的长出需要神经元吸附于允许的底层。一些胞外基质蛋白如：层粘连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白，在原位影响神经丝的长出[1]。这些胞外基质蛋白包含特异的特别适合细胞吸附和神经丝长出的基序[1,2]。要么与多聚物相连，要么单独，胞外基质分子和它们的黏附结构域部分已用于包被表面（如玻璃和聚丙乙烯），如果不这样包被，这些表面将对神经丝的长出支持不良[2]。另外一些诸如多聚L赖氨酸和基质胶也能为神经丝的长出提供良好的支持。玻璃和塑料的几种体外包被已用于检测神经元和单体蛋白材料的相互作用，也用于检测它们对神经丝的长出的作用[19]。可是，这样的体外包被对诸如组织修复和组织工程的某些应用存在严重的局限性。一旦神经元吸附于包被板，如果没有插入诸如多聚体或玻璃的非生物材料它们就不能随时被运输至组织。包被基质胶的盖玻片上生长的神经元展示了控制神经丝的长出和功能性突触联系（图3）。但是，培养的海马神经元在等密度的RAD16生物材料支架基质上能形成广泛的神经丝和功能性突触联系(Fig. 3b)。在RAD16生物材料基质上长成的充满神经元的培养物能随时从一种介质转移至另一种介质中。因此，建立在组织培养中的神经元/肽基质培养物能用于移植。初步的体内研究表明EAK16 和 RAD16基质有良好的容忍性，正如将肽注射入肌肉和大脑及随后的炎症组织分析的研究所表明的一样。
组织工程和修复
生物材料已广泛用于组织工程。最近在生物材料和细胞相互作用的工作集中在空腔（膀胱）和骨组织工程的生物材料的物理特性和维度。组织工程在这两方面的突破强调了模仿自然发生的细胞-细胞和细胞-生物材料支架相互作用的几何构象的生物材料的重要性。为建立新组织和理解掌管细胞分化成合适的新型组织的因子的可得到的前体细胞（如干细胞）的出现对新组织的成功构建也是一个重要因子。最近有几篇关于用于膀胱和骨/软骨组织工程的生物材料的综述[20,21]。
Atala及其同事出版了一本《力的旅游》的书，书中描述了他们成功地将一个组织工程的新膀胱移植入狗体内[22]。一个新器官支架是用合成的混合多聚物的生物材料构建的。生物材料支架是在自体尿道上皮和平滑肌供体细胞中种植出来的，而这些饲养细胞从宿主动物体内收集、分散并扩大培养成尿道上皮和平滑肌细胞库。用共聚物poly-DL-lactideco- glycolide (PLGA)包被的可生物降解的多聚羟基乙酸(PGA)用来构建新膀胱支架。选择这些合成的生物材料是基于它们的生物兼容性和机械特性。PGA 和 PLGA共聚物已比肽生物材料研究得更广泛，而且编织结构的良好处理方法也已得到发展。 细胞种植的新器官移植给亚全去膀胱的狗（即保留部分膀胱的狗）。对照组包括无移植物的和移植没有在细胞中饲养的新膀胱支架的亚全去膀胱的狗。接受在细胞中种植的新膀胱的狗具有正常的留尿功能、膀胱尿动力依从性和移植后长达11个月的组织构造性。这些狗似乎完全恢复，但是，对照组没有表现这些指征中的任何一个的完全恢复。
骨组织工程的需要不同于空腔器官替代所需的.但是，有几篇令人振奋的论文表明骨组织工程与前面的例子有相同的主要元素.其中一个相同点是为保持与天生组织相同的细胞-细胞几何结构的生物材料支架的重要性。3维的细胞-细胞间相互作用和细胞浓度对导致骨组织的形成成熟的正确细胞分化特别重要。另一个主要元素是小心选择和处理用来饲养生物材料支架的前体细胞。软骨再生是另一个对组织工程和生物材料研究的有希望的目标。软骨组织治疗效果差是因为它大部分没有血管。滋养在生物材料支架上的软骨细胞的移植对软骨再生有巨大的前景[25]。另一个对生物材料支架设计和组织工程的考虑包括应用自身供体细胞以防止组织排斥。
对由再生能力较弱的细胞组成的组织来说，组织工程溶液可能更难获得。另外，特别的细胞功能，例如轴突再生和对的神经元形成新的功能性联系，特别在成体动物体内可能受到损害—这些问题是与中枢神经系统(CNS)修复有关。可是，最近的结果表明弱的再生能力与抗生长和抗吸附的信号有关，这些信号要么来自基质（如软骨素硫酸蛋白糖和某些胶原蛋白），要么来自CNS的髓磷脂成分[3]。这些令人鼓舞的结果表明CNS轴突的弱再生能力并不是神经元本身所固有的。因此，这些由人造生物材料基质支架所允许的负面信号的掩盖可能克服这些功能性缺陷。
设计更好的人工肽生物材料支架
最近在组织工程的各个方面的研究强调了协助正确的细胞分化的生物材料支架的几何和物理性质的重要性[22–24]。如果能如同控制非肽生物材料（如PGA 和/或 PLGA 共聚物[2]）一样成功控制肽生物材料的编织，那将是令人满意的。未来在合成的生物材料支架的工作将注重具有更复杂的材料几何构象和诸如更强的抗拉能力的生物材料的设计。将生物活性基序插入肽生物材料中将刺激编织这些材料成良好结构的处理过程的发展。
在自我组装肽支架过程中，有可能限制多肽自我组装成2D结构[26]。这种方法可与半胱氨酸末端修饰的RAD寡肽和以前发展的微接触印刷术联合使用[27]。网格表示半胱氨酸末端修饰的RAD寡肽或乙烯乙二醇硫醇盐的交替形式（见图4）。通过他们各自的SH基团这些分子将与金单层表面形成共价连接。细胞与网格的RAD肽包被区牢固结合，但与乙二醇硫醇盐包被的表面结合不牢（见图5）。令人感兴趣的是这些方法是否能用于翻译更复杂的自我组装肽的3D几何构象。
插入合成生物材料支架的细胞吸附基序（如RGD基序）的特定形式将是另一种控制吸附于支架的不同类型细胞的分组，从而模仿组织。最终目的是合成影响细胞黏附、分化和特定类型的细胞迁移而产生人造组织的生物材料支架。蛋白-蛋白相互作用的基序，而不是细胞吸附基序，也可能应用于合成的生物材料支架。例如，正如蛋白的嵌合插入一样，富含脯氨酸结合在同系序列3(SH3)结构域的配体授予(SH3)结构域与被修饰蛋白的相互作用[28]。更好的合成生物材料支架设计的未来目标包括构建包含能导致生物材料更强的抗拉能力的无机分子或金属结合基团的混合材料。材料设计者能从自然获得灵感。具有高抗拉能力和硬度的自然材料鲍鱼壳是一种有机和无机材料的混合物[29]。生物矿物化的支架对骨修复和其他硬组织修复来说是物理基础。源着这条线，Hecht及其同事构建了来自组合肽文库的自我组装单层[30]。这个文库中的肽是因其具有能折叠成6链两性β片层的特性而入选的。这些两性肽的单层自我组装发生在空气-水的交界面。这些另人兴奋的结果表明了构建由有机蛋白和无机矿物质片组成的片状生物材料的可能性。
结论
本文描述的新肽生物材料支架是生物学灵感的合成材料。正在涌现的技术包括细胞治疗的新支架、组织工程和硬组织修复的生物矿物化。一些最具前景的方法是将新生物材料与干细胞技术结合。这些具有生物兼容性和生物可降解性的新肽生物材料支架可能在新医药方面具有广泛的应用前景。
第四课、组织工程化血管种子细胞研究进展
北京协和医院心外科 张超纪
心血管外科需要各种直径的血管移植物作为修补材料。临床已经应用的血管移植材料有自体血管、异体血管和人工高分子材料管道［如涤纶（Ｄａｃｒｏｎ）和膨化聚四氟乙烯（ｅＰＴＦＥ）］，尽管其能改善和延长患者的生命，但均未达到理想的程度，随着近年组织工程学的进展，构建组织工程人工血管日益受到重视。
理想的人工血管是利用组织工程技术，将活细胞种植于血管支架上，制造出一种与受体组织相容性好、无免疫原性、有活力、耐久性长、可塑性好的生物血管。这种理想的血管不但具有自我修复能力，移植后能维持管腔的长期通畅，而且能为正在成长的患者提供增长能力，从而提高移植血管的长期疗效。
血管组织工程材料
理想的组织工程化血管应具有与生理动脉相似的结构与功能。组织工程化血管研究主要包括以下三个方面：细胞外基质替代物的研究；种子细胞制取、培养、种植的研究；组织工程化血管应用的研究。其中种子细胞制取、培养、种植的研究是关键性步骤。
种子细胞的来源、分离提取、培养和种植
种子细胞的来源
机体的细胞都表达一定的抗原性，特别是内皮细胞具有强烈的同种异体原性，所以组织工程细胞一般采用自体组织细胞，这一点人们已经达成共识。构建组织工程的细胞应是：容易培养，黏附力强；其分子结构和功能与正常血管细胞相似；临床上易取得，具有实用性。
血管壁细胞
自１９７８年Ｈｅｒｒｉｎｇ首先提出内皮细胞应用于组织工程设想以来，该技术在发展上经历了三个阶段：静脉内皮细胞单期种植；微血管内皮细胞单期种植；自体内皮细胞扩增培养种植。
Ｍｕｎｅｒｅｔｔ等对动脉和毛细血管系统进行了研究，他们分别提取了主动脉、心耳毛细血管、动脉滋养血管内皮细胞在体外培养，发现三种不同来源的内皮细胞在组织形态学和内皮细胞标志物（ＣＤ３４、Ⅷ、Ｆｃ、Ｖｌｅｘ、Ｌｅｃｔｉｎ）表达上基本相似，但在功能表达上存在差异。主动脉内皮细胞具有最好的体外培养动力学表现，同时主动脉内皮细胞所形成的毛细血管结构比其他两种细胞形成的结构更稳定持久。所以，主动脉内皮细胞被认为更适合成为组织工程的细胞来源，但是主动脉组织在临床难以获取，最终应用存在一定问题。
造血系统来源的干细胞及间充质干细胞（ＭＳＣ）
ＣＤ３４＋干细胞 有研究表明，左心辅助装置的内腔有单层内皮细胞形成，提示在血液系统中存在内皮细胞的前体细胞。Ｓｈｉ等成功地在外周血、脐血、骨髓中分离提纯ＣＤ３４＋内皮细胞前体细胞——成血管细胞，在体外加入纤维生长因子、胰岛素样生长因子１、血管内皮生长因子，诱导并使之分化成内皮细胞，通过建立狗骨髓抑制模型，证明这些ＣＤ３４＋细胞来源于骨髓，可以在植入的瓣膜表面形成单层内皮细胞层。
间充质干细胞 ＭＳＣ最初是由Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ发现的一类易于贴附于塑料培养板表面的细胞，它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能。在机体内ＭＳＣ存在于许多组织中，尤以骨髓中最多，利用它进行组织工程研究有以下优势：（１）取材方便，且对机体无害，ＭＳＣ可取自自体骨髓，简单的骨髓穿刺即可获得；（２）ＭＳＣ取自自体，由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题；（３）ＭＳＣ分化的组织类型广泛，理论上讲它能分化为所有的间充质组织类型，如：软骨、脂肪、肌肉及肌腱等。目前用于分离ＭＳＣ的方法主要有：密度梯度离心法、贴壁筛选法和流式细胞仪分离法三种。
尽管目前研究还刚开始，这两种细胞却已显现出巨大的潜能，有可能取代成人血管种子细胞而成为最理想的组织工程细胞。
胚胎干细胞（ＥＳＣ）
存在于哺乳动物发育早期胚胎中的（着床前）多能干细胞，具有持续增殖而不分化的能力以及经诱导后可分化形成一个成熟个体中所有类型细胞的潜能。细胞定向分化的尝试在动物中已取得了可喜结果，神经元细胞、造血细胞以及心肌细胞已在体外获得。人ＥＳＣ（包括从中发展的细胞工程和组织工程）要真正在人类医学中得到应用，尚需相当长时间。首先，人们还不能有效地诱导干细胞向特定的细胞类型分化；另外，更困难的是，还不能有效地建立无免疫原性的ＥＳＣ；再者，ＥＳＣ的应用还涉及到伦理道德方面观念的制约。
细胞分离培养种植
组织工程细胞技术可分为三类：（１）分别提取、分别培养、分层种植。取来新鲜组织，对内皮细胞和间质细胞分别提取，然后各自培养，种植时先种间质细胞再种内皮细胞。（２）混合提取、分别培养、分层种植。细胞提取时将内皮细胞和间质细胞一齐取下，体外将细胞分离，分别加以培养扩增，分层种植。（３）混合提取、联合培养、混合种植。两种细胞一并提取，不分离，联合培养，并一齐无序地种植到支架表面。至于哪种方法较好，目前尚无定论。
近年的研究发现，ＥＣ的多种功能是依赖剪切力的。剪切力作为一种调节因子，调节ＥＣ的基因表达。Ｋｉｍ 等提出了动态培养的概念在旋转或震荡中培养，增加了细胞附壁的机会。研究发现，ＥＣ在流动培养下生长良好，血管ＥＣ被拉长，其长轴方向与流场方向趋于一致。在不同流动培养方式作用下，ＥＣ能适应剪切力递增式和阶跃式增加的作用，阶跃式增加剪切力更加方便，在流动培养中切实可行。
展望
血管组织工程作为一门新兴的前沿科学，近年来虽然取得了飞速发展，但最终应用于临床仍存在各种各样的困难，有许多问题需要解决。各种新技术和新方法的出现，将为这方面研究注入新的活力和希望。
第五课 组织工程面临的挑战
利用细胞和合成聚合物建造新器官存在着可怕的障碍，但却是可以克服的。
组织工程正成为医学科学中欣欣向荣的新领域，仅仅在几年前，大多数科学家认为人类组织只能通过从捐献者那里直接移植或利用由塑料、金属和计算机芯片制造的完全人工部件进行替换。许多人认为完整的生物人工器官——由活细胞与自然的或人工的聚合物融合创造的混合物——永远不能制造出来，人类移植器官的短缺问题只能通过某种程度利用来自动物的器官而获得解决。
然而，现在世界各地实验室进行的创新性和富于想象力的工作表明，制造生物混合器官是完全可行的。开发组织工程产品的生物技术公司的销售额己接近40亿美元，并且每年的开支为此额的25％以上。不过，在这些投资通过可靠地减轻许多组织中的疾病所引起的人类痛苦而得到回报之前，组织工程必须克服某些重大的困难。
现成的细胞确定细胞的可靠来源是组织工程的首要前提。动物细胞是个可能的来源，但确保它们具有安全性依然是个令人关注的问题，因为免疫系统对其排斥的可能性很高。基于这些原因，人类细胞是首选对象。
最近，对人类胚干细胞一一能够发育成一系列组织从而形成人的细胞——的鉴别提供了解决此问题的一种方法。但是，从能够操纵培养中的胚干细胞到能够生产可用于创造或修复特定器官的完全分化细胞，研究人员还有很长的路要走。
一个更直接的目标是从组织中分离出所谓的起源细胞。这种细胞向专化方向走了几步，但因为它们尚未完全分化，因而具有足够的灵活性可以补充几种不同类型的细胞。例如，克利夫兰临床诊所Arnold I.Caplan及其同事已从人类骨髓中分离出起源细胞，这种细胞在实验室中经过促导能够形成构成骨的成骨细胞或组成软骨的软骨细胞。与此类似的是，北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校Lola Reid已在成人的肝中鉴别出了小卵形起源细胞，这种细胞在培养物中经过操纵后能够形成成熟的肝细胞(此细胞产生胆汁并消除毒素)或者衬垫胆管的上皮细胞。
培养“万能供体”细胞系可能又是一种方法。为了得到这种细胞，科学家要除掉或利用其他分子去盖住细胞表面的将供体细胞视为“异己”的蛋白质。马萨诸塞州Diacrin公司现正采用这种策略制造人类移植可以接受的某些类型的猪细胞。 Diacrin公司还计划利用“掩盖”技术使细胞在不相配的人供体之间进行移植。该公司已获主管部门批准，就某些肝病开始进行掩盖人类肝细胞的人类试验。
从原理上讲，这些万能供体细胞不会遭到受体排异；它们能从来自许多不同组织的多种类型细胞中产生，并在培养物中不停生长直至需要之时。但尚不清楚万能供体细胞在大规模临床试验中的表现如何。
零部件工厂
寻找生产细胞和组织的最佳途径远非一帆风顺的事情。科学家只鉴定出了几种引导胚干细胞和起源细胞分化为专化细胞的生化信号，我们还不能从骨髓中分离出于细胞和起源细胞的培养物而同时又不让结缔组织细胞如成纤维细胞混入其中。(成纤维细胞是不需要的东西，因为它们分裂迅速并会超过干细胞培养物的生长。)
此外，科学家必须开发出在所谓生物反应器中大量培育细胞的更加先进的方法，生物反应器是安装了将营养物、气体(如氧气和二氧化碳)和废物控制在适当数量水平的搅拌器和传感器的培养室。现有的方法产生的细胞数量常常太少，或者产生的组织片常常比需要的薄。不过，新的解决方案已经出现。几年来，研究人员努力培育足够厚的软骨片以适合于医疗应用，例如取代膝盖中损伤的软骨。但是一旦软骨生长超过了一定的厚度，中心的软骨细胞就会离生长载体过远而吸收不到营养物和气体，无法对生长调节化学和物理信号作出反应，或者不能排去废物。麻省理工学院Gordana Vunjak—Novakovic和Lisa Freed在生物反应器中的三维聚合物载体中培养软骨细胞，从而解决了这一问题。该载体相对疏松的结构和生物反应器的搅拌作用确保所有细胞均匀地附着于载体材料并得到培养媒体的滋润。随着组织在生物反应器中的生长，使其机械特性达到最佳将是极为关键的问题，因为许多组织在受到扩展、拉动或压缩作用时会作出反应，进行重构或改变它们的总体结构。例如，当组织工程软骨在把正在发育的组织暴露给流体作用力的变动的转动器皿中进行培养时，它就会变得更大，从而包含更多的形成细胞外基质的胶原和其他蛋白质基质。基质是类似蜘蛛网的网状结构，作用是支撑细胞生长和构成组织。)以这种方式培育的软骨，包含了细胞外基质蛋白质，从而使其更稳固，更持久，对外力更易作出生理反应。
同样，加州大学圣迭戈分校John A.Frangos也揭示，在生物反应器中搅拌的珠状胶原媒体上培育的成骨细胞比在平坦的静止盘中培育的成骨细胞形成更多的骨无机物。现在杜克大学的Lawrn E．Niklason证实，如果让组织工程小动脉的培养基产生脉动(类似于搏动心脏所产生的血压)，那么这些由内皮细胞(血管衬)和平滑骨细胞构成的管状组织工程小动脉就能展现更接近于自然管的机械特性。另外几个小组(包括我们小组在内)正在开发培养骨骼肌和心肌的方法，这些组织随着物理应力而变得越来越强健。
欲求之特性
了解怎样调节细胞行为是又—个重大挑战。活系统的复杂程度是难以置信的：例如，人肝就包含组织成称为小叶的显微序列的6种不同细胞类型。每个细胞都能完成数百种不同的生化反应。更为重要的是，每个细胞的生化活动常常依赖于同其他细胞间的相互关系和遍布每种组织的细胞外基质网络。举例来说，密执安大学David J．Mooney揭示，肝细胞会根据它们赖以生长的物质的粘性状况而产生不同数量的某一特定蛋白质。为了开发出这类器官一一比如说可以移植的生物人工肝(组织工程的一个重要目标)——研究人员必须更好地了解怎样在不同的情况下培育肝细胞和肝中其他细胞，使其发挥正常生理作用的功能达到最优。了解“重构”对制造将要成为接受者一个永久部分的生物人工器官和组织是极其必要的。在组织工程产品的大多数成功的实验室试验中，组织工程移植物都促进了受者自身细胞和组织的生长，并最终取代了人工聚合物和移植物的移植细胞。例如，我们同波士顿儿童医院的Toshiharu Shinoka和John E.Mayer合作揭示，一旦把由人工聚合物、羔羊上皮细胞和肌成纤维细胞(一种有助于伤口愈合的细胞)构成的心瓣膜小叶移植给羊，它就变得更牢固、更富弹性、更薄。而且，11周之后，小叶就不再含有人工聚合物：它已被重构而只含有羊细胞外基质。不过，控制这种重构过程的生化信号和生长因子依然基本未知。
制造可生物降解并且不会诱导瘢痕组织形成的新材料是组织工程的一个新兴领域，它提出了许多挑战。目前用于组织工程载体的大多数材料都可归于两种类型之一：合成材料如可生物降解缝合材料或天然材料如胶原或藻酸盐(源于藻类的凝胶样物质)。合成材料的优点是，它们的强度、降解速度、微结构和渗透性均可在生产过程中进行控制；而天然材料的优点则在于它们通常更易于细胞附着在其上。现在，研究人员试图综合两类材料的最佳优点来设计具有特别需要的特性的新一代材料。例如，有人正在制造具有模拟特定组织的自然细胞外基质的生物活性区域的可生物降解聚合物。其中有一种包含RGD，即细胞外基质蛋白质纤维连接素的一部分。
RGD是用构成它的三种氨基酸即精氨酸(R)、甘氨酸(G)和天冬酰胺(D)的单字母缩写命名的。许多类型的细胞通常都通过附着到RGD而附着到纤维连接素上，因而包含RGD的聚合物能够为生长细胞提供更自然的环境。
而另一些科学家则打算制造导电的聚合物(这对培育组织工程神经是有用的)，或者制造能迅速胶化的聚合物。这些快速成形的聚合物在可注射生物人工产品中是有用的，这些产品包括可用来填充断骨的产品。
诱导血管生长，也就是所谓血管发生过程是维持许多组织工程器官生存的关键——特别是需要大量血液供给的胰、肝和肾。研究人员通过利用促进血管形成的生长因子包裹支持组织的多聚物载体而成功地促进了在实验室里生长的生物人工组织的血管发生。今后的研究必须考察释放生长因子与控制其活性的最佳途径，以便只在需要的时候和需要的地方形成血管。
面向患者
还有件重要的事情就是，开发组织保存新方法以确保组织工程产品在从工厂到手术室的途中以良好的功能状态存活，且不会在移植过程中死去。在这种情况下，从供体器官移植中改良而来的技术可能是有用的。例如，现在手术医生知道，许多移植器官损伤都发生在再灌注期间，也就是器官连接到受者供血系统之时。再灌注诱导氧自由基的形成，这实际上在细胞膜上刺开了孔，并杀死了细胞。为了避免再灌注损伤，目前外科医生在保存溶液中加入吸收这种自由基的化学物质。还必须找到更好的分子以防止组织工程产品不受再灌注损伤和局部缺血损伤(因血流不充分引起)，并必须完善深低温保藏技术以便生物人工器官和组织能冷冻到需要之时；现在用于细胞的方法还要进一步开发以适合更大的组织。
制定联邦政府主管部门对组织工程产品的审批程序也是个棘手的问题，生物人工组织和器官几乎跨越了美国食品与药物管理局(FDA)所管辖的所有领域，它们基本上是医疗器械；但因为它们包含着活细胞，所以还产生起到象药物那种作用的生物物质。这样，FDA将第一批寻求正规批准的组织工程产品——两种生物人工皮肤一一作为复合产品对待。该机构将组织工程作为一个优先领域并正在提出处理生物人工产品的明确政策。
我们相信，科学家和政府主管部门将清除本文所述的所有障碍，从而在今后几年内为市场带来多种多样的组织工程产品。许多挑战性工作依然存在，但总有一天一一或许从现在起的许多年后——用组织工程器官和组织武装患者就会象今天的冠状旁道管手术那样平常。