自1987 年正式确定“组织工程学”概念以来的10多年时间,在很多基础研究领域已取得显著成绩。在2002 年12 月于日本召开的第五届国际组织工程学术会议上,展示了几乎人体各个部位的组织和一部分器官的基础研究成果,显示出组织工程已经从早期的理论探索进展到了应用基础研究。由于人体组织、器官形态、功能的复杂性,真正要完全用体外培养的组织细胞、生物活性材料替代或再生组织、器官,还需要走相当长的路。由于组织工程化构建涉及到细胞、材料以及细胞与材料的相互作用,体内植入又涉及到免疫、新陈代谢、血液供应、神经支配、功能调节、生长发育、老化等问题,因此需要细胞生物学、发育生物学、分子生物学、移植免疫学、生物材料学、生物化学、临床医学等多学科研究人员的有机结合,共同攻关才能解决。在我国组织工程实验研究中尚有以下几个主要问题值得深入研究。
1. 组织工程的自体细胞移植:由于自体细胞移植没有免疫排斥反应,是研究最多的种子细胞。可由骨髓穿刺获得骨髓间质干细胞,经过定向诱导分化为所需要的功能细胞,用于组织工程化构建;或直接用骨髓间质干细胞移植到受区,在局部微环境下自发转化为功能细胞治疗疾病。用微创技术切取自体组织,分离培养细胞,然后回植入受体修复组织缺损也是一个发展方向。最成功的例子是美国FDA 批准的,通过关节镜技术切取少量非负重部位的关节软骨,由细胞公司培养、扩增到需要的数量,再通过关节镜回植于有病变的关节软骨缺损区取得较好的临床治疗效果。用类似的技术可以分离培养成骨细胞、成肌细胞等用于治疗骨折不愈合及防止肌萎缩,达到个体化治疗的目的。
在这一过程中,需要解决细胞的快速扩增问题,可以通过各种生物反应器、生长因子的应用等使细胞能在较短时间内达到需要的数量。但经过生物反应器及生长因子作用后的细胞,其形态、功能、遗传物质的改变应进行深入研究。只有在确认其安全性后才能用于临床,目前这方面的研究还较少。
2. 同种异体细胞在组织工程研究中的作用:自体细胞虽然有很多优点,但不能用于急症患者,也不能适应群体化治疗的需要。因此同种异体细胞(包括胚胎干细胞、胚胎组织细胞、成体组织细胞) 需要进行深入研究,除了与自体细胞一样,需要研究扩增技术外,尚需研究移植免疫反应、植入体内的远期结局等。每一种组织细胞均有其特定的生命期,随着有丝分裂的进行,细胞会出现老化,并逐渐凋亡。从组织工程产业化考虑,需要用同一个来源的细胞构建大批量组织工程产品,达到产业化。这就需要研究延长细胞生命期及连续传代的技术。正常细胞的生命期是由细胞的端粒长度决定的,如果能延长细胞端粒长度,就有可能逆转细胞老化及凋亡。端粒酶被认为是一种能延长端粒长度的核酸蛋白酶,由蛋白质和RNA 组成。可以其自身的内源性RNA 为模板,发挥RNA 指导DNA 合成的作用。向端粒末端添加( TTAGGG) n 序列,使端粒延长,就能延长细胞寿命。这一技术已经在成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞中获得成功。这可能是同种异体细胞移植或进行组织工程化构建的一条可行途径。但细胞端粒长度也不能无限延长,在体外或体内应研究一种安全有效的调控机制,防止肿瘤化倾向,才能保证临床应用的安全性。
3. 应力与组织工程化构建:应力与生长发育、组织再生、愈合密切相关。正常组织、器官是在特定的应力、微环境下维持其生理功能。但在组织工程研究中,通常是在体外进行构建,虽然可以模拟体内的某些应力及微环境,但很难达到生理要求,这是组织工程研究的难题之一。在可变应力场细胞培养装置条件下进行组织构建,可使细胞沿应力方向延长,粘附能力增强,细胞功能增强。表明力学作用是细胞功能的重要调节因素,并能在组织形成中影响其结构。然而研究者尚未对应力的影响得到充分认识,所以还不可能在组织的工程化构建中创造那样一个体外环境。骨骼肌肉系统组织体外形成后需要解决植入后与受体组织进行组织整合,要求工程化的组织能够与受体周围结构在力学上匹配。因此,有效的构建方法是使组织在体内营养环境及生物力学条件影响下形成。最近出现了一种新的趋势,即在体外进行细胞扩增后,将细胞在手术中注入到支架材料上,在体内进行组织工程化构建,使其在体内的应力及微环境下继续生长,最终修复组织缺损。这项技术由DaPuy 公司首先推出,被称为intraoperative selective cell retention technique 。在动物骨长段缺损的实验中获得成功。这对临床推广应是最有利的。但应深入研究再生组织在完全形成并与周围组织愈合前,如何避免因为不恰当的受力而发生移位或折断,甚至影响组织的再生与愈合的技术。
4. 支架材料研究:支架材料作为人工细胞外基质是组织工程研究的重要内容之一。支架材料在体内组织再生过程中发挥几方面的作用:在结构上加强缺损部位的强度;阻碍周围组织长入;作为体外接种的细胞在体内扩增和增殖的支架;利用与细胞整合素以及受体的相互作用,作为一种可溶的细胞功能调节因子;作为细胞、生长因子和基因的生物载体。由于人体结构的复杂性,目前尚不能确定那一种材料是构建组织工程产品的最佳材料。
用于工程化骨和软组织的支架材料包括合成的和自然的钙磷材料,合成的和自然的多聚物。用于体外组织工程的支架材料和体内促进再生的植入材料需要具有必要的显微结构和化学组成,以容纳间充质细胞并促进其功能发挥,因此研究不同组织构建材料的微孔结构及化学组成是十分重要的。同时材料的降解速度与细胞分泌基质的速度应相匹配。还要研究支架材料降解产生的微粒对宿主和再生组织的影响。
在选择支架材料时,应研究的另一问题是材料的弹性模量。构建的工程化组织不同,对弹性模量的要求也不同。用于骨组织工程的材料应有很好强度,以便能早期承受各种负荷。但过高的强度会改变周围组织的力学分布,这不利于骨的形成及再塑;同时,由于高强度材料进行改性处理,或与其他材料如胶原、壳聚糖等复合,形成复合材料是近来组织工程支架材料研究的发展方向之一。
支架材料研究的另一趋势是用人或动物来源的材料,经过去细胞、部分或完全去有机质或无机质、去抗原等处理,形成生物衍生材料( bio2derived materia) 用于组织工程研究及临床应用。生物衍生材料具有最接近人体的网架结构、生物力学性能、部分活性因子,有利于细胞的粘附、生长及发挥生理功能。材料本身所保留的某些成分具有引导或诱导组织再生的能力,因此是很有实用意义的支架材料,但还需对材料的组织反应、加工成形等进一步研究。
5. 工程化组织的收缩:组织工程研究与应用中,另一个尚未引起足够重视的问题是形成组织的收缩。我们在组织工程软骨的研究中发现,经过体外构建的组织植入体内后成为成熟软骨,但体积明显变小。这是因为材料降解后,由软骨细胞分泌的基质产生了收缩力。据Spector 的研究显示,非肌肉细胞的结缔组织细胞(如成骨细胞、软骨细胞等) 均表达α2平滑肌肌动蛋白(SMA) 基因,这是引起组织收缩的主要原因。它所带来的问题是使组织工程和再生医学所用的支架材料的孔隙塌陷而变小,不仅使植入物变形,还影响细胞的生长、代谢及血管化。为了防止由于α2肌动蛋白的收缩作用,一方面可以对材料进行改性处理以增加其抗收缩力,另一方面可以对细胞进行基因改造,但目前这方面的研究还不多。
6. 生物活性因子在组织工程中的应用:在组织修复、再生过程中,有多种生长因子参与活动。在组织工程研究中,生物活性因子的作用也是十分重要的。构建不同的工程化组织需要不同的生物活性因子参与,如骨形成有BMP2 、BMP4 、BMP7 、TGF2β、IGF21 ,bFGF 等参与,问题是这一过程常不是单一因子在起作用,多种因子的有序作用、信号传递通路等尚不清楚。另外,这些因子的给药途径及剂量也需要深入研究。在工程化组织构建中,一次性给予某个剂量只能在组织修复的早期起作用,在后期很难维持其作用的有效性。一方面是由于因子本身的半衰期短,很快失效;另一方面,容易被体液稀释、吸收,使局部难以达到有效浓度;同时也存在剂量过大,吸收太多,引起全身作用的危险,这是各种因子应用安全性必须解决的问题。
将各种因子的基因通过转染技术,使其在种子细胞内表达,将这种转染细胞用于组织工程构建,在实验研究中已获得成功。如将BMP2 、BMP4 、BMP7 基因转染成骨细胞,可加速成骨过程及骨修复能力。问题是如何提高转染率,使细胞能高效表达。另外,对这种细胞的安全性也需要进行监控。虽然基因转染技术尚未用于临床,但在免疫问题、调控问题解决之后,将会对组织工程及再生医学产生重要影响。