杨 军
,苏宝山,王康敏,司履生3 ,王一理3(西安交通大学第二医院病理科; 3 生命学院,陕西西安 710004)
摘要:组织芯片技术为进行多种肿瘤的多指标(DNA、mRNA、蛋白指标) 高通量原位分析提供了时间、空间和资源的可行性并最大程度上保证实验条件的一致,可广泛应用于肿瘤候选基因及其临床特性的确定、肿瘤预后的判断、肿瘤免疫治疗效果的评价以及肿瘤的分子诊断、肿瘤治疗靶点的筛选,显著加速基因组学和蛋白组学成果在肿瘤临床中的应用。
随着分子遗传学、基因组学和蛋白组学的进展,新发现的基因病和疾病特异性基因及其相关的分子学指标数量的骤增,组织芯片(tissue chip) ,也称组织微阵列(tissue microarrays ,TMAs) ,作为生物芯片的一个重要分支,已经成为促进分子遗传学、基因组学和蛋白组学研究成果迅速向临床应用转化和研究肿瘤基因型和表现型的重要工具[1 ,2 ] 。本文仅就组织芯片技术在这一方面的应用及其发展现状予以简单介绍。
1 组织芯片的制作
无论从设计思路、制备方式,还是检测方法等方面比较, 组织芯片与基因芯片和蛋白芯片均有迥然不同的差异。因此,组织芯片的制备,具有其独特的操作工艺流程和适用领域(见表1) 。
表1 组织芯片与基因芯片、蛋白芯片的区别
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组织芯片 |
基因芯片 |
蛋白芯片 |
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靶分子种类 |
不同样本中同一蛋白或基因 |
同一样本中不同基因 |
同一样本中不同蛋白 |
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标本类型 |
组织标本 |
体液、组织提取液中的核酸标本 |
体液、组织提取液中的蛋白标本 |
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检测方式 |
原位检测 |
非原位检测 |
非原位检测 |
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分析工具 |
光学显微镜 |
扫描仪 |
扫描仪 |
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制备工艺 |
简单 |
复杂 |
相对简单 |
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成本 |
低 |
高 |
较高 |
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自动化程度 |
低 |
高 |
较高 |
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用途 |
不同组织样本中同一蛋白或基因的原位检测 |
同一样本中的不同基因的检测 |
同一样本中不同蛋白的检测 |
尽管自1998 年Kononen J [3 ] 报道组织芯片技术以来,相继有许多学者对这一技术进行了改进和完善,我们也研制出了一系列相应的半机械化组织芯片制备器具,并申请了我国在组织芯片领域的第一项专利,但就目前而言,现有组织芯片的制备技术仍较为繁琐和缓慢,特别是对组织芯片的分析,仍局限于人工分析或半自动化分析,容易出错。因此,建立自动化程度更高、可信性更强的组织芯片制备和分析方法,才能使组织芯片与基因芯片和蛋白芯片一样真正成为生物芯片,适应大样本、多中心研究的需要。正是这样,在许多学者的努力下,组织芯片的制备和分析技术已经向着自动化的方向发展。并已经研制出了组织芯片自动化制备系统,有的学者还建立了可用于研究蛋白指标的亚细胞定位和定量分析的组织芯片自动化技术[4 ] ,甚至有的学者还建立起了可供多用户使用的具有自动摄取图象、标号、建立档案的网络系统[5 ] 。还有学者建立了基于组织芯片的敏感的自动化荧光图象定量分析( tissue microarray -based quantitative fluorescenceimage analysis , TAM - QFIA) 技术[6 ] 。
与此同时,使用OCT包埋冰冻组织,制备组织芯片,克服了石蜡包埋对蛋白和mRNA 的影响,扩展了组织芯片的材料来源[7 ] 。此外,我们则采用精细切割的方法,对普通细胞爬片进行切割,并将多达40～60 张切割后的微小细胞爬片粘贴在同一张普通载玻片上,制备出了细胞微阵列切片,也有学者采用琼脂糖空洞包埋法制备细胞微阵列切片[8 ] 。因此显著提高了对培养细胞的检测效率,对于细胞学研究具有重要意义。
可见,伴随着组织芯片技术向着自动化的方向迈进,其本身也向着更为广阔的方向发展,具有更加广阔的外延和内涵。
2 组织芯片的可信度的评价
由于组织芯片中的微组织样本均来源于原始供体蜡块,是活检组织的活检,因此,组织样本的大小能否代表供体标本信息? 成为这一技术是否可靠的理论基础,也是实验者所关心的焦点问题。理论上,0. 6mm直径的组织样本可包含600～1 ,300 个以上细胞[3 ] ,我们采用了直径1. 5mm 组织样本,理论上可包含4 ,000～20 ,000 个细胞,能更全面的代表原组织结构,保持组织完整性,而韩国学者甚至将组织样本的直径增加到2.0mm[9 ] ,可见,组织芯片足可以反映原组织结构的信息。同时,作者对82 例乳腺癌组织中ER、PR 表达率的检测, Hoos A 对59 例纤维细胞瘤Ki267、p53 和pRB 蛋白表达的检测, Mucci NR 等对50 例前列腺肿瘤中CGA 和SYN 的观察及Garcia JF[10 ]对淋巴瘤的研究等一系列对比性研究均证实组织芯片技术具有与传统方法同样的敏感性和准确性,可以替代传统制片技术用于肿瘤生物学的研究。但是,也有学者发现采用这一技术仍会出现一定的偏倚[11 ] ,因而有学者建议,采取一式二份[12 ] ,甚至至少3 点的方式挖取组织方可保证组织芯片技术的有效性和可行性[13 ] 。但是,作者认为,在采用多点取材的同时,使用同一规范化的取材标准是保证组织芯片技术可靠性的重要原则。
3 组织芯片的应用
组织芯片技术为进行多种肿瘤的多指标(DNA、mRNA、蛋白指标) 高通量原位分析提供了时间、空间和资源的可行性并可保证实验条件最大程度上的一致[14 ,15 ] 。具有显著加速探索肿瘤分子改变和临床病理特征间相互关系的分子学研究的潜在价值,因此,这一技术已经成为分子病理学家和解剖病理学家的重要工具并已经广泛应用于肿瘤研究的各个方面[16 ] 。
3. 1 组织芯片技术与免疫组化技术结合用于蛋自水平的研究
应用组织芯片技术, Kononen J [3 ] 研究了1000 例乳腺癌中p53 和ER 的表达。Richter J 在两周内检测了1842 例膀胱癌患者中2317 份样本中cyclin E 基因的表达。Natkunam检测了1335 例人体恶性肿瘤组织和正常组织,发现MUM1 蛋自表达于淋巴瘤和恶性黑色素瘤明显相关。Rimm DL 仅使用几毫升的抗体便完成了600 多例肿瘤病人20 年生存状况分析。Rubin MA 对1 ,220 例各种前列腺疾病组织进行检测,发现E－cadherin 在激素不敏感前列腺癌中的表达明显增强。HsuFD[17 ]检测了351 例标本中22 种蛋白指标的表达。可见,组织芯片技术为有效评估和研究不同类型肿瘤中新表达蛋白的潜在价值提供了一种有效的新方法[18 ] 。
3. 2 组织芯片技术与FISH技术和ISH 技术结合用于基因水平的研究。
运用组织芯片技术和FISH(fluorescence in situ hybridization , FISH) 技术, Barlund M和Andersen CL[19 ] 等人分别检测了372 例和3520 例组织样本中定位于17q23 的多种基因的表达。Bubendorf L 等学者检测了371 例前列腺组织样本中AR、MYC、Cyclin2D1、ERBB2 和NMYC 等五种基因。同样, Schraml P 等在一周内检测了17 种肿瘤397 例样本中CCNDl , CMYC 和ERBB2 三种癌基因的表达,发现三种癌基因在不同肿瘤中具有不同的表达水平。作者将组织芯片技术与原位杂交( In situ hybridization , ISH) 技术结合发现hTER 和hTERT表达上调、分布紊乱对与鉴别人体肿瘤的良恶性具有重要意义,并有可能作为恶性肿瘤诊断的病理组织学指标[20 ] 。
3. 3 与基因芯片技术结合用于差异表达基因的筛选及疾病特异性基因的确定
基因芯片技术对于筛选候选基因具有重要作用, 但是, 只有通过大样本的组织学分析才可能最终确定最为可能的候选基因。组织芯片技术正是提供了一个在保证实验条件高度一致的情况下进行高效、高通量识别潜在侯选基因或肿瘤特异基因的方法,并有助于确定新的诊断指标和治疗靶点,促使基础研究向临床应用转化[21～23 ] 。
应用组织芯片和基因芯片技术, Monni 确定了定位于17q23 的与乳腺癌密切相关的17 种已知基因和26 个高表达序列标记。Pollock PM观察了黑色素瘤中CDKN2A 的遗传学突变和Mousses S 研究了前列腺癌进展的分子机制。
总之,组织芯片技术和基因芯片以及传统组织学技术的结合为肿瘤组织中差异表达基因及其编码蛋白产物的鉴定和性质的确定提供了一种强有力的策略,改变了我们进行各种疾病的研究方式,可为肿瘤的治疗个体化方案的选择提供参考[24 ] ,并可用于肿瘤分子学改变与临床病理特征的相关性的研究[17 ] ,同时,这一技术也相继用于包括乳腺癌、淋巴瘤、软组织肿瘤在内的各种肿瘤的临床病理学研究[25～27 ]和肿瘤恶性程度及患者预后的判断[28 ] ,甚至肿瘤免疫治疗效果的评价[29 ] 。此外还可用于药物毒性效应的观察[30 ] 。除此以外,组织芯片技术还可用于生物试剂的研制、生物工程制药、中药有效成分的筛选等领域, 同时也为病理组织学教学和实现组织学实验室质量控制以及建立标准化实验体系提供可能,并有可能使现有的研究方式和工作流程发生巨大改变[31 ] 。
4 展望
总之,组织芯片技术作为一项重要的组织学研究手段, 伴随着其制备、分析过程的自动化程度的提高及其内容和形式的更加丰富,将会在很大程度上改变原有的研究模式,也将会与其它先进的分子生物学技术一起在后基因组时代的功能基因组学研究领域发挥巨大作用,并在分子诊断、筛选靶向药物、药物检测以及确定肿瘤治疗的靶点的临床特性和功能分析中发挥巨大作用[32～34 ] 。
作者简介:杨 军,男,31 岁,病理学博士,主治医师。研究方向:肿瘤病理学。
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