刘新生,张阳德,王 欣,张 蕾(卫生部肝胆肠外科研究中心湖南, 长沙 410008)
摘要: 目的 介绍21 世纪最前沿科学即纳米技术在疾病诊断中的应用现状与展望。方法 通过检索国内外文献资料, 从传感器、生物芯片、药物载体及细胞分离技术等方面进行论述。结果 纳米技术在疾病诊断中已初步显示了其巨大优势。结论 纳米技术必将在疾病诊断中引起一场新的技术革命, 但广泛应用于临床尚需努力。
隧道扫描显微镜( scanning tunneling microscope, STM )和原子力显微镜(atomic force microscope, AFM ) 的问世, 使人们能够在纳米尺度上了解生物大分子精细结构及其与功能的关系, 并动态获取生命信息。疾病的早期诊断也就有了变为现实的可能。目前肿瘤诊断最可靠的手段是建立在组织细胞水平上的病理学方法, 但仍存在良、恶性及细胞来源判断不准确的问题。利用A FM 便可在纳米水平上揭示肿瘤细胞的形态特点, 通过寻找特异性的异常纳米结构改变, 从而解决肿瘤诊断的难题。随着纳米技术的发展, 其在疾病诊断中的作用将会越来越重要。下面仅就主要的纳米技术手段在疾病诊断中的状况作一论述。
1 纳米生物传感器(nano-biosensor)
生物传感器(biosensor) 是以生物学组件为功能性识别元件, 识别和感知目的被测量并将其按一定规律转换为可识别信号的器件或装置。纳米生物传感器是利用纳米材料实现了传感器结构的超微化。纳米材料用于生物传感器是A larie 和Vo2D inh等人[ 1 ] 1996 年提出的, 并为检测BPT (Benzo[ a ]pyrene tetrol) 开发和确定了以抗体为基础的纳米生物传感器。VoDinh 和他的同事认为[ 1, 2 ]: 这一高选择高灵敏的纳米传感器, 可用于监控活细胞的蛋白质和其他所感兴趣的生物化学物质; 提供细胞中BPT 定位方面的重要消息及其在细胞癌变过程中的运输情况; 还可用于筛选微量药物, 以确定哪种药物能有效阻止细胞内致瘤蛋白的活动。有学者将荧光素(荧光蛋白) 结合靶向因子, 通过与肿瘤表面的靶标识别器结合, 在体外用测试仪器显影确定肿瘤的大小和部位, 进行恶性肿瘤和其他疾病的早期诊断[ 3～ 5 ]。基于金属纳米颗粒尺寸光学效应构建的生物传感器, 如纳米颗粒区域等离子共振传感器(L SPR ) 等, 有望实现单分子检测的非标记技术[ 6 ]。
我国学者方晓红[ 7 ]首次将分子信标(molecular beacon)DNA探针用于DNA、蛋白质相互作用的研究。Molecular beacon 作为一种全新的荧光探针, 开辟了定量分析DNA、蛋白质相互作用的新途径。并将单分子技术与光纤技术相结合, 实现了利用光纤探针进行单分子检测及CCD 成像的新方法。一种具有超高灵敏性激光单原子分子探测术问世, 可通过人的唾液、血液、粪便以及呼出的气体, 及时发现人体中哪怕只有亿万分之一的各种致病或带病游离分子, 从而实现疾病的早期诊断[ 7 ]。1997 年12 月,清华大学研制成功一种新型的纳米影像学诊断工具——光学相干层析术(OCT )。其分辨率可达1 个微米级, 较CT 和核磁共振的精密度高出上千倍, 但弡却感器等。后者接受的是一种酶, 所以有可能连续地监测单个细胞释放出的谷氨酸, 而谷氨酸是中枢神经系统中的一种重要的神经递质, 这就使我们有可能更好地理解人体内感觉传导的机制, 从而为神经生理学研究提供一种有力的工具。随着纳米技术的进步, 利用纳米级微小探针技术, 向人体内植入传感器, 并根据不同的诊断和监测目的, 定位于体内的不同部位, 或随血液在体内运行, 随时将体内细胞的各种生物信息反馈于体外记录装置, 从而实现对单个细胞健康状况的评定及早期发现癌细胞的形成。纳米生物传感器技术有可能成为21 世纪医学界常用的手段。
2 生物芯片技术(biochip technique)
生物芯片(biochip ) 是在很小几何尺度的表面积上装配一种或集成多种生物活性材料, 仅用微量生理或生物采样, 即可同时检测和研究不同的生物细胞、生物分子和DNA 的特性以及他们之间的相互作用, 从而获得生命微观活动的规律。生物芯片可分为细胞芯片、蛋白质芯片和基因芯片(DNA 芯片)等几类, 不同的芯片具有不同的功能, 但都有集成并行和快速检测的特点, 所需标本少, 检测与诊断过程完全自动化处理, 减少了人为的失误。临床上可用于肿瘤的诊断、分类和药物选择。肿瘤的分子分类将解决传统病理组织学分类、分型不能解决的问题, 为实施正确、有效的治疗提供基础。
科学家们设想, 利用基因、蛋白质芯片组装成“纳米机器人”, 通过血管送入人体去侦察疾病。注入人体血管内的机器人, 能从溶解在血液里的葡萄糖和氧中获取能量, 并按医生的指令, 通过体外编制好的声信号程序, 探测在体内碰到的病变, 完成对疾病的诊断和治疗[ 10 ]。目前的一些研究结果表明, 用DNA 芯片技术可以实现癌症的快速精确检测, 这表明DNA 芯片技术在肿瘤诊断中具有较好的应用前景[ 11 ]。Steven 等[ 12 ]利用p 53 为靶标、多种p53 突变片段为探针的寡聚核苷酸芯片成功地检测了原发性肺癌。美国国立癌症研究所建立了一种三维分析方式用于前列腺癌的诊断[ 13 ]。Alizadeh 等[ 14 ]设计了一款特异cDNA 芯片, 可以在分子水平鉴别出传统方法不能鉴别的肿瘤异质性。Brenton 等[ 15 ] 用DNA表达芯片对浸润性乳腺癌进行研究, 发现其基因表达谱存在明显差异, 据此提出了一种针对雌激素受体阴性乳腺癌新的分类方法。Stratoma 等[ 16 ]应用1024 个基因的cDNA 微阵列也证实慢性淋巴瘤中B2Cell 的基因表达谱与其临床预后和分期有着显著的相关性。国内有人对不同病理阶段的食管鳞状细胞癌的基因表达谱进行了类似的研究, 结果发现在轻度增生不良期, 一些已知和肿瘤相关的基因就出现了高表达或低表达, 为早期诊断和治疗提供了依据[ 17 ]。血液细胞被导入一个发射激光的腔体表面, 从而改变激光的形成。癌细胞会产生一种明亮的闪光, 而健康细胞只发射一种标准波长的光, 以此鉴别癌变[ 18 ]。美国哈佛大学的You[ 19 ]和Kane 等[ 20 ]研制出了可以捕捉和固定单个细胞的生物芯片, 用于细胞分类和纯化, 还可以通过调节细胞间距离, 研究细胞分泌和胞间通讯。纳米技术与生物芯片结合已应用于基因测序、文库筛选、遗传病诊断、新药开发、炎症相关基因及病原体检测等领域[ 21, 22 ]。
Kricka 等[ 23 ]研制了一种以硅为基底, 采用微加工技术制作的PO2、PCO2 和pH 传感器, 供血气检测的硅芯片, 其分析精度适合临床检测的需要。Livache 等[ 24 ]在硅基质上合成的寡核苷酸芯片用于血清样品中的丙型肝炎病毒分型。然而, 研究人员最看好的还是生物自身的纳米装置, 即DNA 分子及生物细胞中各种细胞(亚细胞结构) 和分子结构, 因为细胞本身就是“纳米技术大师”, 细胞中所有的酶都是能完成独特任务的“纳米机器”, 它们在微观世界里能极其精确地制造物质, 而这正是科学家希望通过纳米技术实现的梦想。弄清并模拟这种分子量级(纳米量级) 的供能转化过程, 实际上就是纳米医学的研究与应用过程。它将极大地促进我们对生命现象的理解和对疾病的认识。纳米生物计算机可以为远程医疗提供强有力的支持手段, 其主要材料之一就是通过生物工程技术产生的蛋白质分子, 并以此作为生物芯片。这种芯片能发挥生物体本身的调节机能, 自动修复芯片上发生的故障, 还能模仿人脑的机能等。纳米生物计算机的发展将使人们享受到更好的医疗, 在动态检测中发现疾病的先兆信息, 使早期诊断和预防成为可能, 并能部分替代现代医学中X 线透视、血管造影和磁共振成像等技术, 必然给现代医学的诊断和治疗带来一场深刻的革命[ 25 ]。
3 纳米药物载体(nano-carrier of drug)
纳米技术对药物研究领域的不断渗透和影响,也引发了药物领域的一场革命。在药物开发研究领域, 运用纳米技术开发的药物克服了传统药物许多缺陷以及无法解决的问题。已经开发的纳米材料作为药物的载体已显示出了其独特的性能。诊断方面,纳米药物载体主要应用于影像学领域。国外在20 世纪80 年代末开始着手进行超顺磁性氧化铁超微颗粒的研究, 90 年代把这种造影剂应用于临床, 效果很好。但这种造影剂工艺复杂、价格昂贵, 在我国还难以广泛应用。中国医科大学第二临床学院放射科专家陈丽英教授, 利用中科院金属研究所的纳米技术应用于医学研究, 经过4 年的努力, 完成了对超顺磁性氧化铁超微颗粒脂质体的研究, 并终获成功。通过动物实验证明, 运用这项研究成果可以发现直径3 mm 以下的肝肿瘤, 结果清晰可靠, 可达到在临床上早期发现、早期诊断、早期治疗的目的。这项新成果成本低、操作简便, 如应用于临床, 甚至可以进行普查工作, 对肝癌早期诊断和治疗具有十分重要的意义。还有人将纳米高分子粒子应用于疑难病的介入诊疗[ 26 ] , 也取得满意效果。
4 纳米细胞分离技术( cell dissociation technique)
生物细胞分离是细胞学研究中一种十分重要的技术, 在临床诊断上有广阔的应用前景。20 世纪80年代初, 人们开始利用纳米微粒进行细胞分离, 建立了用纳米SiO 2 微粒实现细胞分离的新技术。其基本原理和过程为: (1) 制备SiO 2 纳米微粒, 大小在15～ 20 nm 范围, 结构一般为非晶态, 并将其表面包覆分子层, 包覆层的选择主要依据所要分离的细胞种类而定, 多选择与所要分离细胞有亲和作用的物质作为附着层。这种SiO 2 纳米粒子包覆后所形成复合体的大小约为30 nm。(2) 制取含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮胶体溶液, 适当控制胶体溶液浓度。(3)将纳米SiO2 包覆粒子均匀分散到含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮胶体溶液中, 再通过离心技术, 利用密度梯度原理, 使所需要的细胞很快分离出来。此方法的优点是: (1) 易形成密度梯度, 纳米包覆体大小约30 nm , 因而胶体溶液在离心作用下很容易产生密度梯度。(2) 易实现纳米SiO2 粒子与细胞的分离,这是因为纳米SiO2 微粒是属于无机玻璃的范畴, 性能稳定, 一般不与胶体溶液和生物溶液反应, 既不会沾污细胞, 也容易与它们分开。美国科学家用纳米SiO2 微粒很轻易的便将怀孕8 周左右妇女血样本中极少量的胎儿细胞分离出来, 并能准确判断胎儿是否有遗传缺陷[ 27 ]。同时, 他们还研究用纳米微粒检查血液中的心肌蛋白, 以帮助治疗心脏病。利用纳米微粒进行细胞分离技术很可能在肿瘤早期即可从血液中检查出癌细胞, 实现癌症的早期诊断和治疗。
挪威工科大学的研究人员, 已经利用纳米磁性粒子成功地进行了人体骨髓液中肿瘤细胞的分离[ 27 ]。纳米技术在细胞学方面的另一应用是细胞染色技术。纳米微粒的出现, 为建立新的染色技术提供了新的途径。借助复合粒子分别与细胞内各种器官和骨骼系统结合形成的复合物, 在白光或单色光照射下呈现某种特征性颜色(如10 nm 的金粒子在光学显微镜下呈红色) , 从而给各种组织“贴上”了不同颜色的标签, 因而大大提高了细胞内组织的分辨率。庄俊玲等[ 28 ]报告, 国产磁珠对细胞有较好的分离效果, 且对细胞活性的影响较小, 随着制作工艺的完善, 有望逐步替代进口产品。
5 问题与展望(question and prospect)
尽管纳米技术在医学诊断中有其广阔的前景,但由于目前尚处于起步阶段, 还存在一些问题和不足, 主要表现在: (1) 纳米知识的普及不够, 专业人员匮乏; (2) 芯片、传感器等制作成本高, 其结果的可靠性分析还不够简便; (3) 对用来分析结果的计算机及其专业软件要求高, 还需要计算机软件和生物信息学的完善与拓展; (4) 芯片技术需大量已测知的、准确的DNA、cDNA 片段序列信息, 但目前仍缺乏可得的、经证实准确的基因序列, 尤其是全长的cDNA序列; (5) 许多技术指标、应用范围还不够完善; (6)还没有理想的纳米药物载体平台; (7) 大部分处于实验阶段或小规模临床试用阶段, 还未产业化, 昂贵的仪器设备限制了其临床应用。尽管如此, 我们有理由相信, 随着纳米技术及相关科学的发展、普及与产业化, 上述问题便会一一化解。纳米技术应用于疾病诊断, 必将在医学诊断领域中引发一场新的技术革命, 使诊断、检测技术和临床医疗向微型、微观、微量、微创或无创、快速、实时、功能性和智能化的方向发展。
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