[ 摘要] 基因工程小鼠是当今生命科学中集成度最高的综合性研究体系之一, 在认识“基因2蛋白质2生命现象”、制备人类疾病研究的实验动物模型, 以及新药开发的评价体系等领域中具有重要作用。随着生命科学中功能基因组学的兴起和模式生物时代的到来, 使得生物医药研究对基因工程小鼠的需求日趋增加, 同时也促使基因工程小鼠技术体系得到了快速的发展。然而, 在基因工程小鼠的产生中, 仍存在着一些问题。它们的解决, 则需加强一些与基因工程小鼠直接相关的基础问题和有潜在应用价值的基础问题的研究。
小鼠是生物医药研究中的常用实验动物。最近来自基因组分析的资料表明, 它的基因与人类的相似性高达95% 以上, 这从另一个角度进一步说明了它作为实验动物的特殊优势。小鼠的基因组可被人为地定向修饰或改造, 由此产生基因工程小鼠。基因工程小鼠本身就可以作为一个独立的活体研究体系, 在认识“基因2蛋白质2生命现象”的相关性研究中非常有效, 而且被认为是当今生命科学中集成度最高的综合性研究体系。当然, 基因工程小鼠也可作为人类疾病研究的实验动物模型, 以及新药开发的有效性和安全性的评价体系等。上世纪的80 年代初, 在中国科学院细胞生物学研究所施履吉院士和复旦大学遗传学研究所刘祖洞教授等老一辈科学家的倡导和推动下, 我国的基因工程小鼠研究开始起步。通过这些年的发展, 这一领域正在趋于成熟, 并已进入实用阶段。然而, 当今生命科学中功能基因组学的兴起和模式生物时代的到来, 以及加入W TO 后给我国生物医药产业所带来的严峻挑战, 使得我国本来就存在的生物医药研究对基因工程小鼠的供需矛盾变得更为突出。如何应对这一新的形势, 确实需要我们思考和着手解决。
1 基因工程小鼠的现况
1. 1 转基因小鼠( transgenic mice) 指基因组中整合有外源基因的工程化小鼠。最早的典型例子就是1982 年由美国R. D. Palmiter 实验室所产生的“超级小鼠”。通常的作法是采用显微注射方法, 将所要研究的基因注入受精卵的雄原核, 再将其受精卵植入假孕小鼠体内, 使其生长发育, 以致生出新生小鼠, 然后以分子生物学方法(如基因组DNA 的PCR或Southern blot 等) 从所得到的新生鼠中筛选出基因组中整合有所导入基因的小鼠。这种小鼠就是平常所说的Founder 小鼠。随后, 便可进一步将该培育成遗传学上稳定的小鼠品系。通过这种途径, 可以得到带有特定外源基因的小鼠品系, 可以作为医学研究的实验动物模型, 也可以“正面地”观察其外源基因活动的规律和其表达产物(蛋白质) 对小鼠生长发育和生理活动的影响。
1. 2 基因剔除小鼠(gene knockout mice) 指特定的内源基因被剔除后的工程化小鼠。最早的典型例子出现于1989 年, 美国有两个实验室分别报道了他们的工作。一个是MIT 的R. Jaenish 实验室关于B微管蛋白基因的剔除, 另一个是哥伦比亚大学的E. J. Robert son关于C2A bl 基因的剔除。目前的方法有两种: (1) 在培养的ES 细胞(胚胎干细胞) 中直接将目的基因剔除或破坏, 即组成型基因剔除。其大致过程是利用同源重组原理将体外培养的ES 细胞内源的某个特定基因剔除或破坏, 再将这种ES 细胞植入早期小鼠胚胎的胚泡腔内, 使其参与胚胎的发育(因ES 细胞具有发育多向性) , 从而得到嵌合体小鼠。然后采用经典遗传学方法筛选出生殖系统是由所植入的ES 细胞发育而来的个体, 进而便可培育出遗传学上稳定的小鼠品系。然而这种方法的一个最大问题是致死效应, 即当所剔除的基因是在生长发育过程中起重要作用的, 其胚胎常常是致死的。(2) 使目的基因的剔除发生在发育过程中人为的任一阶段和特定的组织细胞中, 即诱导型基因剔除。大致的过程是: 利用同源重组原理在ES 细胞中的目的基因(可以是整个基因, 也可以是基因中的一个部分) 的两侧各加一个loxP 位点(为很短的一段核苷酸顺序, 在重组酶Cre 的催化下, 两个loxP 位点之间可发生同源重组, 故可导致目的基因的缺失) , 再将这种工程化ES 细胞移植入早期胚胎的胚泡腔内, 使其参与胚胎的生长发育, 以得到遗传学上稳定的、目的基因的两侧带有loxP 位点的小鼠品系。然后再将这种小鼠个体与带有C re 基因的转基因小鼠(其C re 基因可被诱导性的启动子或组织特异性表达的启动子所控制) 进行交配, 或通过其他途径, 便可得到目的基因的两侧含有loxP 位点、同时也含有C re 基因的小鼠个体。再进一步将这类小鼠个体在适当的时候作诱导处理, 便可实现对目的基因进行定时和定位缺失的目的。这种方法的最大优点是能够有效地克服致死效应。通过建立基因剔除小鼠的途径, 可以得到具有特定基因缺陷的小鼠品系, 可以用作医药研究的动物模型, 也可以观察到当所研究基因的表达产物(蛋白质) 缺少时, 对小鼠的生长发育过程和生理现象的影响, 也就是说能够从“反面”认识基因的功能。
1. 3 基因替换小鼠(gene knockin mice) 指与某种生理现象相关的两个基因中的一个基因编码区被另一个基因编码区的拷贝所替代的工程化小鼠。最早的典型例子是1995 年8 月由美国纽约大学的A.Joyner 实验室所报道的关于E ngra iled 1 基因和E ngrailed 2 基因替换的工作。大致的作法与上述的基因剔除小鼠十分近似, 也是要利用同源重组原理, 而且也是在对ES 细胞工程化的基础上进行的。主要的不同点在于一个基因的编码区被去除的同时, 另一个相关基因编码区的拷贝被替换, 其结果是: 在同一个基因组中的这两个相关基因的启动子分别控制着同一个基因的编码区。如果它们都表达, 其产物则是一样的。然而在实际情况下两个启动子常常具有不同发育特异性(即在不同的发育阶段起作用) , 故通过这种途径可以探讨在结构上可能完全不同的两个基因的产物是否具有同样的生物学功能。如美国M IT 的R. Jaen isch 实验室发现, 当小鼠的myf 5基因被剔除后, 其肋骨不能形成。但用myogenin 基因编码区的拷贝取代myf 5 基因的编码区后(内源的myogenin 基因无任何改变) 可正常发育, 从而证明了myogenin 基因的产物完全可以代替myf 5 基因产物的功能。这个途径对于多种基因的产物在活体内功能活动的相关性分析和基因在分化过程中活动行为的示踪分析很有意义。
2 工程技术体系的发展
2. 1 大片段DNA的转基因小鼠 目前可以制备700 kb (甚至1 100 kb) 的转基因小鼠, 采用的方法是显微注射、脂质体转染或原生体融合。这种转基因小鼠的最大优点是可以消除相邻关系对目的基因功能活动的影响, 从而提高分析结果的真实性。但其技术比较复杂, 而且周期很长。
2. 2 Cre-loxP 系统的利用 采用Cre-loxP 系统可以人为地控制转基因表达或基因剔除事件的定位(组织特异性启动子) 和定时(诱导型启动子)。
2. 3 转基因整合的定位系统 为了提高转基因的整合效率, 有人正在作这种尝试。基本的考虑是将对小鼠本身无害又有利于目的基因表达的位置作为外源基因整合的目标位点。再设计一种工具载体, 其中含有可用于目的基因插入的多克隆位点、目标位点的同源区及检测标志基因等。
2. 4 其他相关技术的发展 基因转移的方式、体内标志系统及核移植等。
3 制备中存在的问题
3. 1 致死效应 常表现为不能着床、流产或出生后死亡, 这种情况在转基因小鼠和基因剔除小鼠的产生中均可出现。其主要原因一是外源基因的随机插入, 造成了小鼠的某个对于生长发育至关重要的基因的破坏; 二是转基因的异常表达(时间或空间的异常) 扰乱了小鼠胚胎或新生小鼠的生长发育。
3. 2 表达不理想 这是转基因小鼠制备中的常见问题。制备转基因小鼠的基本目的通常是目的基因的高表达。如果在所得到的转基因小鼠中, 其目的基因不表达或表达水平不高, 那就失去了转基因的基本意义。导致这种情况的原因很多, 如转基因的结构及其在染色体上整合的位置等。
3. 3 无表型 有时为了改变小鼠的某个或某些性状, 虽然其基因组也按预定的计划作了改造, 却得不到所预期的表型效应。这种情况在基因剔除小鼠中尤为多见。其主要原因可能是由于互补的结果, 因为在活体内任何一种表型都可能是由一个反应网络所决定的, 虽然基因的剔除可以使相应产物缺失, 并由此导致相应反应环节的“阻塞”, 但其他的旁路仍然可能“走通”。就目前来说, 这种互补现象的出现是很难预见或人为控制的, 只有在工程小鼠完成以后才能知道。当然, 除了这些具体的技术问题外, 也存在着由此而产生的工业化程度低的问题。
4 基因工程小鼠的主要应用
4. 1 分析特定基因表达产物的生物学功能 转基因小鼠和基因剔除小鼠均可采用。在采用转基因小鼠系统进行“正面”分析时, 基本的要求是目的基因的高表达和关键基因插入突变的避免。理想的状态是将目的基因人为地整合在有利于表达的区域内, 并能人为地控制其表达的时间性和空间性。如果采用基因剔除小鼠进行“反面”分析时, 理想的情况是要能够人为地控制剔除事件发生的时空性, 以保证能够得到可供分析的小鼠。
4. 2 探讨基因活动的调控机制 转基因小鼠和基因剔除小鼠均可使用。在选用转基因小鼠时, 最基本的要求是目的基因所存在的外源DNA 片段应当是基因组DNA 片段, 而且应当是尽可能的大。当然, 也要尽可能地避免关键的内源基因的插入突变。在采用基因剔除小鼠时, 最好也要能够人为地控制剔除事件发生的时空性。
4. 3 建立特殊的基因工程小鼠品系 要得到一个符合要求的品系, 最基本的要求是能够生长发育和繁殖后代。对于转基因小鼠品系, 如果目的基因产物的毒性作用不大, 只需避免内源关键基因的插入突变和保证目的基因表达量能够达到一定水平即可。如果目的基因产物的毒性作用较大, 则还需尽可能地做到对其表达时空性的人为控制。对于基因剔除小鼠品系, 如果其目的基因对生长发育和生殖能力的影响不大, 可将其做成组成型剔除。反之, 则需做成诱导型(即条件型) , 否则就不可能得到有用品系。
4. 4 生物反应器的研究 通常是在制备大型转基因动物之前, 采用转基因小鼠系统来评价重组基因的有效性(即表达水平的高低及其方向性) 和表达产物的安全性(即对生长发育有无明显的毒害作用)。这样操作可以有效地节省时间并降低成本。
5 展 望
作为一个研究体系, 基因工程小鼠提供了在RNA、蛋白质、形态学或生理学等不同水平直接观察所研究的基因在活体内的活动情况, 以及其表达产物所引起的表型效应的可能, 从而可有效地将复杂的生物学问题分解为多个因素分别进行考察, 也能将涉及多系统或多学科的问题集中到同一个体内进行综合考察, 这就使得以前看来是难以想象的、甚至是不可能的复杂生命现象的研究变得相对简单和可行。而且, 基因工程小鼠具有四维特性, 所研究的问题都是在活体动物中进行的, 类似于人体内的各种背景因素仍然存在, 研究结论通常具有很高的“真实性”。在当今的生命科学中, 由于“基因－蛋白质－生物体结构或功能”之间关系的明确, 许多生命现象或医学问题的探讨通常是一种多层次(分子水平、细胞水平及活体水平) 和多侧面的综合研究。所以, 从客观上讲, 基因工程小鼠具有很高的可应用性。
目前, 基因工程小鼠技术体系的总体水平虽然很高, 但要解决高通量生产的问题, 并能满足个性化需要, 一些基础性问题的研究则需加强, 如: (1) 寻找和利用理想的整合位点, 以提高转基因的有效性和避免致死现象的发生; (2) 人为控制目的基因的表达或剔除事件的发生, 以避免致死。这对于希望得到其目的基因具有致死效应的基因工程小鼠品系显得尤为重要; (3) 提高大片段DNA 转移和整合的效率, 以保证基因活动的真实性。当然, 除了这些直接相关的基础研究外, 还应包括那些具有潜在应用价值的基础性研究。我国生命科学研究的发展速度很快, 基因工程小鼠研究应当在高水平和高通量方面作出努力, 以配合人类疾病防治研究、新药开发研究和功能基因组学研究等领域的高水平发展。