摘要 蛋白质微阵列是即基因芯片技术之后,又一重大的技术突破。它在蛋白质组学的研究中将起重要作用,可以用于疾病诊断、毒理学和药理学研究和环境监测等方面。它具有高通量、自动化、灵敏度高和可用于多元分析等优点。就蛋白微阵列的原理、相关的制备方法与检测技术及其应用等方面进行了阐述,并对现阶段该技术存在的不足和发展前景进行了讨论。
蛋白质微阵列(又称蛋白质芯片) 是继基因芯片之后,作为基因芯片功能的补充发展起来的。和基因芯片相似,它在固相支持物表面高密度排列探针蛋白或抗体点阵,可特异的捕获样品中的分子, 然后用激光扫描系统或CCD(电感耦合器件) 获取数组图像,最后用专门的计算机软件进行图像分析、结果定量和解释。纽约Rochester 大学生物化学家蛋白质微阵列的开创者Phizichy 指出蛋白质微阵列可能有一些甚至比DNA 芯片更有利的优点。基因微阵列通过检测mRNA 的丰度或者DNA的拷贝数来确定基因的表达模式和表达水平, 然而根据mRNA 的水平(包括mRNA 的种类和含量) 并不足以估计蛋白质的表达水平。实际上,对于某些基因,当mRNA 的水平相等时,蛋白质的表达水平可以相差20 倍以上;反之,当某一蛋白质的表达稳定于一水平时,各转录mRNA 的水平也可相差达30 倍[1 ] ,所以说单凭基因芯片检测结果是不能完全反应出生物体内的蛋白质水平,要想得到完整的生物信息,其解决办法之一就是直接研究基因的表达产物———蛋白质。蛋白质微阵列技术是沟通基因组学和蛋白质组学的强大工具和桥梁。随着人类基因组测序的完成,下一个挑战是理解数目巨大的基因信息和确定大量蛋白质的功能,蛋白质组学的研究因此集中在发展新的技术方法来解释蛋白质的功能和复杂性[2 ] 。随着技术体系和生物信息学的研究取得突破,蛋白质组学的研究迅猛发展取得了重大突破。蛋白质组学已经作为一个独立的大范围、高通量的蛋白质分析技术出现[3 ] 。它将会在促进我们发现新的药物靶标、理解基因的功能和复杂的生物学通路的过程中扮演重要的角色[4 ] 。
蛋白质组学的发展依赖于用双向电泳分离细胞蛋白, 用质谱法和生物信息学的方法的三大技术方法联姻所取得的进展。而蛋白质微阵列技术的出现正是这一进展的标志。蛋白微阵列具有和基因芯片一样的潜力,会对生物学、医学、环境监测和卫生监督等产生巨大的影响。蛋白质微阵列技术会显著的拓宽现在蛋白表达与蛋白相互作用分析的范围[5 ] 。
1 蛋白质微阵列的分类与制备
1.1 蛋白质微阵列是研究生物化学和分子生物学的强大工具
它可以分为两类,一是蛋白质功能阵列,它是在载体上固定数千种天然蛋白质,蛋白质可以从cDNA 文库转录或通过其他技术获得,这种阵列可以用来对蛋白质功能作大规模平行检测。另一种可以称为蛋白质检测阵列,这种阵列固定了大量蛋白质的配体,可以用来研究蛋白质组学研究[6 ] 。
1．2 蛋白质微阵列的构建
1.2.1 载体的选择和处理 制作蛋白微阵列最常用的载体有:硝化纤维、PVDF 膜、硅树脂、玻璃和塑料[7 ] 。玻璃是最常用的抗体微阵列平台。然而,它必须用1 :1 的甲醇和盐酸完全的清洗干净然后用化学方法修饰以便于共价结合蛋白。玻璃的化学修饰方法有很多,戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、琼脂糖修饰法和巯基修饰法等,这几种修饰法中聚赖氨酸修饰法固定蛋白量大、背景低、信噪比高是较好的方法[8 ] 。
1.2.2 探针蛋白的制备 对于蛋白微阵列来说所应用的抗体或蛋白的收集是很关键的。现在制作蛋白质微阵列的瓶颈是如何产生大量活性蛋白。单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白,但是传统的杂交瘤细胞技术用于抗体的研制所需时间长,制约了抗体阵列密度的发展。而基因工程抗体技术给蛋白微阵列的发展带来了新的机遇[9 ] 。噬菌体抗体库技术就是典型的代表,它可以有效的同时处理大量的分子,而且抗体分子可以不通过动物的阴性选择,能从任一种属获得少有的抗体专一性和提高亲和力。最近de Wildt[10 ] 等用scFv 抗体制作微阵列,阵列化的抗体在数周乃至数月后仍保持稳定。
1.2.3 探针蛋白在载体上的固定 为了在固相支持物上固定蛋白并同时保持活性和折叠构象,目前已经有两种重要的方法来达到这个目的: (1) 利用聚丙烯酰胺凝胶可以吸附4000kDa 大小的蛋白质分子,而且其吸附的蛋白能够保持原来的功能, 然而有反应速率较低和准备步骤复杂等缺点。(2) 通过化学健牢固的将蛋白固定到固相支持物上, 准备步骤较为简单以及能于多种仪器连用(例如机器人印刷术) 使得这项技术比凝胶吸附方法更容易接受[11 ] 。例如,采用预先用含乙醛的特殊试剂处理过的载玻片,用高精确印迹蛋白的机械手点纳升量体积的蛋白质于载玻片上(点阵密度为1600 点Pcm2 ) , 乙醛与载玻片上的蛋白质的伯级胺反应形成Schiff’s 碱从而使蛋白质连接到载玻片上,再用小牛血清白蛋白BSA 处理载玻片表面,然后用N , N′2二琥珀酰胺基碳酸盐溶液(N ,N′－disuccinimidyl carbonate) 活化BSA 的赖氨酸、谷氨酸残基, 使其易与印迹蛋白的表面胺作用形成共价脲连接或酰胺连接,印迹的肽或小分子则可在载玻片BSA 单分子层保持立体构象,易于与溶液中的大分子起反应[12 ] 。对于感兴趣的蛋白应该纯化连接生物素以达到最大的单向固定,这也是一个检测蛋白是否保持功能的方法[13 ] 。
1.2.4 封闭 封闭液通常用含小牛血清白蛋白的缓冲液,其目的不仅是封闭微阵列上未结合的醛基,同时也在微阵列表面形成了一层BSA 的分子层,减少了以后步骤中其他蛋白的非特异性结合。
2 蛋白质微阵列的检测
目前,对于吸附到蛋白微阵列表面的靶蛋白的检测主要有两种方法。一种是直接检测法,通过利用质谱技术可以直接分析靶蛋白的分子量和相对含量。另一种为蛋白质标记法, 样品中的蛋白质预先用荧光物质或同位素标记,结合到微阵列上的蛋白质会发出特定的信号,使用相应的照相技术或激光扫描技术对信号进行检测,再经过相关的软件分析,即可获得相关的生物学信息。
3 蛋白质微阵列的应用
3．1 生物学标志物的检测
由于蛋白质微阵列具有高通量的性质,加快了生物学标志物的发现和确认的速度。Ciphern Biosystem 公司利用蛋白微阵列检测了来自健康人和前列腺癌患者的血清样品,在短短的3 天内发现了6 种潜在的前列腺癌的生物学标志[14 ] 。如果利用过去的方法也许要花费数月到数年的时间。
3．2 用于生物分子间的相互作用的研究
近年来,研究蛋白质相互作用的主要方法是酵母双杂交技术。但是该技术存在着许多局限性,例如假阴性和假阳性,酵母体内表达的外源蛋白质不能正确的折叠,蛋白质翻译后修饰及表达过程的条件难以控制等。蛋白质微阵列技术是在体外条件下进行操作,突破了酵母双杂交技术的局限, 可以直接检测目标蛋白质。例如Ge 等[15 ] 应用了一低密度通用蛋白质阵列( universal protein array ,UPA)来研究蛋白质、DNA、RNA 和小分子化学配体探针的相互作用,通过测试人蛋白P52 与点在醋酸纤维素膜上纯化的48 种蛋白质的反应来鉴别高亲和力蛋白质之间的相互作用。
3．3 药物靶标及其作用机理的研究
疾病的发生发展与某些蛋白质的变化有关, 如果以这些蛋白质构筑微阵列,对众多的化学药物进行筛选,直接筛选出与靶蛋白作用的化学药物, 将大大的推及药物的开发。另外蛋白质微阵列有助于了解药物与其效应相关蛋白的相互作用, 为临床用药提供实验依据,并能进一步建立和发展外源化学药物与蛋白质表达谱的数据库,促进药理学和毒理学的研究。
3．4 蛋白质功能的研究
蛋白质功能的多样化、复杂化使得蛋白质的研__究工作非常艰巨。如果利用蛋白质微阵列技术来研究蛋白质将大大地减轻工作量。例如可以用蛋白质微阵列来寻找和鉴定功能蛋白,已有实验表明,应用蛋白微阵列技术鉴定出的胶原结合蛋白p29 为乳酸杆菌表面活性剂中的功能蛋白,它可以调控乳酸杆菌黏附宿主细胞从而相应抑制病源肠球菌的黏附[16 ] 。利用蛋白质微阵列技术可以寻找到肿瘤相关的磷酸化蛋白,明确其性质功能及作用机制,可能会为治疗肿瘤找到一条新的途径[17 ] 。
3．5 疾病诊断
应用蛋白质微阵列技术可以制作诊断性和筛查性芯片。如将18 种自身免疫性疾病的相应抗原固定在芯片上,将待测病人的血清加入反应体系, 最后加入标记酶的二抗, 加底物显色。根据显色位置的不同可判断出为何种抗体阳性,从而诊断出相应的疾病[18 ] 。筛查性芯片多用于肿瘤的早期诊断。据报道美国已经研制出评价心脏病风险的新型蛋白微阵列,这种微阵列可以和血清中的心脏病危险因子,例如C2reactive 蛋白和白介素26 结合[19 ] 。Perrin 等[20 ] 将HIV、HBV 和HCV 病毒的蛋白和基因点在同一张芯片上, 基因用来检测病毒的基因, 蛋白捕获血清中的抗体, 这种技术可以更加准确的诊断出相应的疾病。
3．6 在卫生检验中的应用
军事医学科学院卫生学环境医学研究所成功的对农药阿特拉津、罂粟碱、对硫磷半抗原进行了衍生化,并且将该衍生物与大分子蛋白质OVA 进行了偶联,合成了完全抗原。载玻片表面经硅烷、戊二醛处理,通过双功能试剂把抗原或抗体共价结合在载玻片表面,制作了检测小分子的污染物蛋白微阵列,对阿特拉津最低检测限为01001μgPml , 罂粟碱最低检测限为0101μgPml 。同时, 以葡萄球菌肠毒素为识别分子,研制了检测大分子物质的蛋白微阵列,对葡萄球菌肠毒素的A 型、B 型、C 型进行了检测, 其最低可检测0101μgPml 、0101μgPml 及011μgPml 。目前, 检测环境内分泌干扰物雌二醇、壬基酚的免疫微阵列也在研制之中。
4 蛋白微阵列的不足和发展前景
改进蛋白质微阵列的重要因素是提升蛋白质表达系统,使其能产生大量可溶性、初生态表达的重组源蛋白。现有的E1coli 表达系统存在许多的不足之处, 而Leuking 等[21 ] 最近采用的Pichia
pastoris 与E. coli 建立的双重表达系统结合了两者的优点,无需亚克隆,提高了可溶性蛋白的表达水平。另外蛋白质和其他分子相互作用的多样性和蛋白质分子性质的差异对蛋白微阵列的制作来说是一种挑战。有几种关键的进展已经被报道,尤其是三维凝胶微阵列可以用有限的资源进行制作,并且具有灵活性高、容量大、具有均匀的溶剂环境和在各种条件下都能进行实时记录、检测的优点。
近年来人们对环境和食品安全提出了更高的要求,而危害人们健康甚至生命的重大食品安全事故也屡有发生,如何建立快速、灵敏、准确的卫生检验方法对于疾病的防治、环境检测、食品安全具有重要的意义。蛋白质微阵列技术具有快速、平行、高通量的优越性,在卫生检验中与传统方法相比具有巨大的优势,为卫生检验工作提供了一种先进的检验手段。但是这一崭新的技术仍存在一些缺点, 有待于进一步的发展和完善,如何将之有效的运用到卫生检验工作中去仍然有待于进一步的探索。
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