摘要: “蛋白质组学”概念自1994 年提出之后, 其研究技术得到了突飞猛进的发展,主要采用的是双向凝胶电泳,但该方法存在很多不足,尤其在蛋白质的检测手段和定量分析上还不尽如人意。目前广泛使用的染色技术是银染和考马斯亮蓝染色,荧光染色等更准确和灵敏的检测技术也为蛋白质组学技术提供了不可比拟的技术支持。差异凝胶电泳和同位素代码标记的出现,对以双向电泳为核心的传统方法提出了创新和改进, 新产生的多元化的分析方法将大大加强目前双向凝胶电泳的应用能力,促进其解决更多的基础问题。
蛋白质组(proteome) 这一概念是由澳大利亚学者Wilkins 等[1 ] 于1994 年提出, 指的是由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。在蛋白质组学研究领域主要使用双向凝胶电泳(2D) 和质谱来进行蛋白质的分离和鉴定,双相凝胶电泳目前使用最为广泛,第一相为等电聚焦,根据蛋白质等电点的不同进行分离,第二相为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) ,根据分子量的不同进行分离。通过该项技术可以得到关于等电点、分子量、相对丰度、蛋白质同功型、修饰、亚细胞位置、蛋白质相互作用等信息。但该技术仍有很多不足,如:1) 操作步骤自动化程度低;2) 重复性差;3) 等电点较大(大于9)或较小(小于4) 的点不易得到分离, 疏水的蛋白和难溶的膜蛋白及大分子量、低丰度蛋白也都不能被检测到,使得在其后的分析中忽略了这些蛋白点[2 ] ;4) 一张胶上最多只能检测到3000 个左右的蛋白点,很多蛋白可能共同移到了一个点上,造成了定量和质谱分析的准确性降低。双向电泳后对蛋白质的筛选和定量分析也一直没有理想的技术和方法,主要原因在于双向电泳的重复性差。例如,在凝胶图像分析中,蛋白点的边界难以确定, 胶与胶之间的背景值和点的强度都需要均化来消除胶之间的差异, 而且匹配时也会有很多难以避免的误差[3 ] 。而且由于双向电泳技术越来越多地用于分离目的蛋白进行质谱分析, 所以人们希望得到与质谱技术相融合的蛋白质显色技术。所以,除了要求显色方法的灵敏度、线性和重复性要好, 还要求它能与现代的蛋白质组学分析技术衔接完好。
目前常用于蛋白质检测的技术包括有机染料染色、银染、放射同位素标记、负染、荧光染色等方法。两种新近出现的相差显示蛋白质组学方法(differential display proteomics) ,如差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis ,DIGE)和同位素代码标记(isotope coded affinity tags ,ICAT) ,对以双向电泳为核心的传统方法进行了改进,它们正在得到进一步的应用和研究。
1. 传统的检测方法
传统的考马斯亮染技术由于其较低的成本、使用方便和与下游的蛋白质鉴定技术的良好相容性得到了非常广泛的使用。但其缺点在于胶与胶之间的重复性差且由于胶本身的差异而难以控制。在改进的方法中, 通过应用胶体染色颗粒,胶本身可不被显著着色。其原理是通过在染色过程中形成胶体颗粒和染料之间的平衡,染料进入胶内与蛋白质点结合,胶体颗粒则被阻挡于胶外,因此使得胶本身不着色。通常传统的考马斯亮蓝染色和胶体考马斯亮蓝染色能检测到8～10 和30～100ng 的蛋白[4 ] ,局限在于它的检测灵敏度和线性动态范围比较小。银染技术比考染灵敏度高,是通过将胶浸泡于含银离子的溶液内,从胶面上洗掉非紧密结合的金属离子,加入某些试剂使与胶内蛋白结合的银离子形成金属银来显色。该方法可检测到纳克级的蛋白质,其线性动态范围在40倍范围内。但银染步骤非常复杂, 繁多, 胶与胶间的重复性较差, 有报道差异可达到20%[5 ] 。目前有些自动化的银染过程将有可能减少这种差异。银染时加入醛类作为固定剂虽然可以提高检测灵敏度, 但这样将干扰Edman 测序和质谱分析。
放射性同位素标记方法常用3H、14C、35 S、32 P、33 P 和125 I 等来进行标记,该方法大量用于体内的代谢实验。然而,近来用放射标记来检测蛋白质合成速率的方法也受到了质疑。如在代谢实验中,混入放射物如35 S2蛋氨酸, 在标准剂量和作用时间下,可引起DNA 的断裂, 增加P53 蛋白水平,改变细胞和细胞核的形态使细胞周期停止或引起凋亡[6 ] 。虽然该方法的灵敏度比较高,但使用放射性物质不但危险而且成本很高,还需要很大一部分经费用于检测、货存管理和实验人员的培训。
还有很多文献报道了关于在SDS-PAGE胶上使用负染的方法,包括使用氯化钾、氯化铜、氯化锌、乙酸钴、氯化镍和锌2咪唑等。目前3 种最常用的负染方法是使用氯化钾、氯化铜和氯化锌。其中,氯化铜的染色灵敏度略高,氯化钾的灵敏度则远低于考马斯亮蓝染色法。氯化锌法是目前灵敏度最高的负染方法[7 ] 。
荧光染色在定量的准确性、灵敏度以及蛋白质识别和鉴定的现代下游技术的相容性等方面超越了传统的染色技术如考马斯亮蓝染色法和银染。SYPRO Red、SPYRO Orange和SYPRO Tangerine 3 种染料可一步检测SDS2PAGE 胶上的蛋白质,只需30～ 60min ,且无脱色步骤, 可检测到4 ～ 8ng 量的蛋白[8 ] 。但不足之处在于试剂价格较贵。目前以荧光染色和质谱为基础的方法学正为蛋白质组的多元定量分析提供不可比拟的新的技术支持。
2. 相差显示蛋白质组学
蛋白质组学通常用于分析样品蛋白质之间的差异。传统方法是在不同的胶上分离不同的样品,分别进行检测和定量,然后各个组别的胶进行匹配。目前有很多图象分析软件,如BIO2RAD 公司开发的PDQuest , Amersham Pharmacia Biotech 开发的ImageMaster 2DElite ,Genomic Solutions 开发的BioImage-2D Investigator 等。然而由于胶与胶之间的差异很大, 重复性不高,如何提高检测和定量的准确性仍是一个很大的问题。各实验室往往通过将同一样品重复跑出多块胶后, 用平均值进行定量以消除实验误差。但匹配的准确性也往往很低,需要消耗大量时间和精力来进行
人工匹配。差异凝胶电泳和ICAT 方法通过多元分析来得到蛋白质组方面更多的信息, 它们的出现将大大提高胶与胶之间的重复性和结果的可信性。
2.1 差异凝胶电泳
将样品在电泳前标记Cy2、Cy3 和Cy5 这3 种荧光染料,然后将标记后的3 种样品混合, 同时在一块胶上进行电泳,即为差异凝胶电泳(DIGE) [9 ,10 ] 。所得到的2D 胶图像可使用3 种不同的激发P发射过滤器得到不同颜色荧光信号,根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异,这样可避免在匹配时出现的误差,进行定量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。用于标记的荧光基团在化学结构上相似,分子量也基本相同,都带有正电荷,所以在与赖氨酸残基反应时,保证了所有的样品可以移至相同的位置。该方法的灵敏度可与银染和SYPRO Ruby 相媲美, 可检测到100～200pg 的蛋白质,线形动态范围在5 倍左右[11 ] 。已有很多文献证明该方法的灵敏性和重复性,如用该方法研究苯甲酸对大肠杆菌的抑制作用和食道癌的特征蛋白。该方法也提高了定量上的准确性。由于实验方法本身造成的蛋白质斑点强度的差异,比如样品在进入胶条时会有一些样品损失,但在同一块差异凝胶电泳胶上就不会出现这样的差异。目前出现了一种改良了的DIGE 技术使其更好的进行定量分析, 该技术将Cy2 作为用Cy3、Cy5 标记的蛋白质内标, 用以比较数据库中各个胶之间的蛋白质的量的差异。DIGE 可在同一次检测中通过分析单一胶上的相互覆盖的信息来得到蛋白质的信息,可以同时在一块胶上在相同电泳条件下分离2～3 个样品,大大减少了一个实验需要的胶的总数[12 ] 。
虽然从理论上来说,该方法非常诱人, 但DIGE 本身还有很多技术上的问题。如:1) 只有当约1 %～2 %的蛋白质的赖氨酸残基在荧光标记时修饰,才可以维持被标记的蛋白在电泳时的溶解性[9 ] ;2) 在DIGE 染色中丢失的蛋白质基本确定为样品中的低丰度蛋白; 3) 虽然经染色后在电荷上未发生变化,被染料标记的蛋白质比未标记的蛋白质点向大分子方向有轻微迁移,主要是由于荧光团的加入。这使得在标记的和未标记蛋白之间产生95 %的误差, 之后在质谱分析时产生更多的复杂问题。可通过再染色的方法以使割点的步骤不出错。但考马斯亮蓝染色比DIGE 染色方法灵敏度低,有约40 %的兴趣蛋白质点不能从考马斯亮蓝染色的胶上被发现[10 ] 。因此,高灵敏度的染色方法SYPRO Ruby 被用于作为DIGE 后染色的方法。4) 另一个值得注意的影响灵敏度的问题是荧光物质在激发P发射过程中会出现信号的相互干扰。引发Cy3 的激发波长有时可引起Cy5 标记的蛋白发射。
2.2 同位素代码标记技术
同位素代码标记技术( ICAT) 应用一种含与蛋白质反应基团、乙烯甘油结合区和生物素标记的试剂。目前,商品化的ICAT试剂可专与蛋白质或肽段的L2半胱氨酸的巯基反应, 所带的同位素标记为含8 个氢原子的(d0) 轻试剂和8 个氘原子的( d8 ) 重试剂[13～15 ] 。一般的实验步骤是将一个蛋白质样品用轻试剂标记, 另一个样品用重试剂标记, 然后将两个样品混合, 经胰蛋白酶或Lys-C 水解蛋白得到肽片段。混合的样品用抗生物素蛋白亲和层析法分离。这些肽段还可以进一步通过反向毛细管液相色谱、MALDI-TOF(Voyager DE PRO) 或QSTAR QQ2TOF 和质谱进行分析,质谱后得到的相差8Da 的同位素分子质量峰,这些峰的比率可以作为与原样品各个蛋白相关量的测量尺度, 如一对峰相差8 个质量数,则为同一种蛋白质, 由D0和D8 峰的相对强度进行相对定量。由于ICAT在化学结构上相同且在分子量上只相差8 个中子,所以在用MS 检测时相对量的可信性有所提高。同样的, LC-ESI-MS 也可根据重和轻肽段的相对量提供蛋白的定量信息[16 ] 。它无需繁冗的双相凝胶电泳技术, 对低丰度蛋白的直接捕获测定以及可靠性都较以往的检测技术有所提高。它的其他好处和意义在于:1) 将混合样品(来自正常和病变细胞或组织等) 直接测试;2) 快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质、尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等;3) 快速找出重要功能蛋白质(疾病相关蛋白质) 及生物标志分子,进而快速用于疾病诊断。
将ICAT 技术和2D 技术结合可克服ICAT技术本身的一些不足。将两种不同的蛋白质样品分别用重ICAT试剂和轻ICAT试剂标记,混合后用2D 进行分离, 而后进行染色、切割、胰酶消化,用质谱进行分析得到图谱,并且可将部分肽段选择出来用碰撞诱导电离(CID) 来评价或搜索相关的数据库。由于ICAT标记后的半胱氨酸在分子量上增加了422Da , 所以减少了电泳时的移动性。
ICAT试剂是亲水性的,保证了样品良好的溶解性,但偏碱性的蛋白质的等电点可能有所改变[17 ] 。也有文献报道同时用3 块胶,分别将两个样品标记重ICAT 试剂和轻ICAT 试剂,跑两块含单独样品的胶和一块两个样品混合后的胶,来定量检测转录后修饰出现的蛋白质的同分异构体。
由于细胞和组织蛋白质水解消化非常复杂,往往在一个样品上就能产生上千的肽段, 这为使用ICAT 技术研究生物系统带来了很多困难。虽然分离出了只含半胱氨酸的肽段进行分析, 将样品的复杂性缩小到原来的1P10 ,但仍需要其他分离方法来减少肽段的量以利于其后的质谱分析。ICAT 要求半胱氨酸残基的侧链有适当距离的蛋白酶水解位点[18 ] 。有文献报道在对多亚单位膜蛋白大肠杆菌F12F02ATP 合酶进行研究时,显现出了该不足[19 ] ,但可以通过使用能与半胱氨酸残基以外的其他蛋白质残基反应的ICAT 试剂标记样品[20 ] 来改善实验效果。
3 结语
在人类基因组研究基本完成后, 人们将科研的工作重心转到了蛋白质组研究方面。这使得过去10 年中蛋白质研究技术得到了突飞猛进的发展,也出现了大量灵敏度更高、更有效的检测方法。与此同时,色谱、质谱、芯片技术等也正得到了普遍的应用, 很多新技术如DIGE 和ICAT 技术也为蛋白质组学研究提供了很大的支持,虽然这些技术都有一些不足, 但都可作为双向电泳的辅助手段。电泳技术因其简单可行和高效性仍将处于主导地位,且正被应用到更广泛的领域。相信这些技术和方法将为生命科学研究带来更多的成果,带来科技上的更大的进步。
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