摘要: 蛋白质作为生物体最基本的功能单位,一直被看作是开启生命奥秘的金钥匙。但由于其数量巨大、种类繁多、结构复杂、功能变化莫测,使人们对它的研究始终难以有突破性的进展。能够像研究基因组那样大批量研究蛋白质即绘制人体蛋白质图谱一直是科学家努力的目标。但由于方法的局限,过去的蛋白组学研究通常集中在用比较蛋白组学的分析方法去研究人体蛋白。随着蛋白组学分离技术(二维电泳、质谱等) 的不断改进与提高, 人体简单系统蛋白质全谱的检测已成为可能。通过对目前蛋白质全谱研究最为全面的脑脊液、尿液及唾液检测技术的分析介绍,希望给未来的研究工作提供一点借鉴。
二十世纪是人类对自身存在的遗传基础获得巨大认识的一个时代。从DNA 的结构到疾病相关基因的定位,从基因表达调控到基因治疗的深入研究及应用,基因一直是生命科学研究的重点及热点[1 ] 。随着人类对基因图谱破译的结束,人们正逐渐把目光从基因组学转向蛋白组学。1995 年,蛋白组学这个名词由Marc Wilkins 首次提出, 它是指对整个基因组的所有蛋白质的研究[2 ] 。但是,随着研究的深入进行, 人们发现蛋白组远比人们预先构想的“一个基因翻译一个蛋白质”的说法要复杂的多。蛋白质组包括在某一个特定的时间内一个细胞或有机体内出现的所有蛋白质,这不仅包括直接从基因序列上翻译的蛋白质,也包括各种来源于选择性剪接、翻译后加工及两者结合的被修饰蛋白质[3 ] 。蛋白质组学是在人类基因组计划研究发展的基础上形成的新兴学科,它的主要任务是识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质, 并分析蛋白质的功能及其模式。从这个角度讲,蛋白质组的研究可分为两种类型,一种是针对细胞或组织的全部蛋白质,即整个蛋白组的研究; 另一种是针对一个特定的生物学机制或机制相关的全部蛋白质,即相对整体而言的局部蛋白组的研究。与此同时,更多的蛋白质组研究工作则是将着眼点放在蛋白质组的变化或差异上,也就是对蛋白质组的比较分析的研究策略。
从2000 年下半年开始,人们逐渐将重心转移到蛋白质组表达谱的研究中,但对于人类重大疾病的蛋白质组研究却通常采用比较蛋白质组分析方法。学术上,在基因组、转录组基础上的蛋白质组全谱研究,微生物已有成功的报道,但是在高等生物尤其是哺乳动物中很少见报道,人类组织或细胞的蛋白质组全谱研究则刚刚涉及。到目前为止,记载能够检测到某一个组织或细胞的所有蛋白质的文献少之又少,而由于物种演化中进化上的差别,人类基因组、转录组、蛋白质组的全景式比较,对于不同层次人类基因表达调控规律的认识必不可少; 此外, 人类基因组序列草图虽已公布,但是所估计的315 万左右基因中一半左右纯属理论推测, 需要从蛋白质组水平予以检验与确认, 因此开展人类组织或细胞的蛋白质组表达谱的分析研究工作势在必行。在这里, 我们简单介绍蛋白组学在人体内蛋白质数量及种类相对简单的组织脑脊液、尿液及唾液蛋白质全谱检测方面的应用,希望通过对前人研究工作的归纳、整理,为今后的研究工作提供一点借鉴。
1. 人类脑脊液及脑组织蛋白质组的检测
由于脑脊液(Cerebrospinal fluid ,CSF) 比邻于大脑且在临床上可以轻易获得,因此对脑脊液的蛋白质分析具有重要的临床诊断价值。中枢神经系统疾病能够显著影响脑脊液中蛋白质的浓度以及蛋白质存在的模式[4 ] 。脑脊液中的蛋白质分析结果可以作为一种预先设置好的标志(Marker) , 以此追踪脑失调的病人经过复合治疗后的治疗效果。脑脊液中的多数蛋白质是血清蛋白质,而只有很少数的蛋白质来源于中枢神经系统。中枢神经系统相关蛋白质的鉴定及描述对于发展新型临床神经标志物及研究不同类型神经系统退化性疾病的神经化学基础及发病机理具有重要的价值。随着人类基因组的完成, 利用蛋白组学技术鉴定人类大脑蛋白质已变得越来越容易。
O’Farrell 首次提出在IEF 之后用SDS-PAGE(isoelectric focusing) 进行二维凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis ,2-DE) 的分离技术[5 ] ,即蛋白质首先根据其等电点的不同利用IEF 在一维空间上加以分离,再根据其分子量的不同利用SDS( sodium dodecyl sulfate) 电泳在二维空间上进行二次分离。其后, 该技术又被Anderson 应用于血清蛋白质的分离[6 ] 。该技术对于分离生物体液内成千上万的蛋白质是一个非常有效的方法, 同时也是检测蛋白质表达的一个非常好的手段。人类CSF 蛋白质图谱于1980 年首次提出[7 ] 。从那时起,几个研究组织已经开始应用这个方法进行人类CSF 蛋白质组的研究[8～12 ] ,分别在神经系统紊乱中CSF 蛋白质差异性改变、CSF与血清蛋白质谱的区别以及CSF 蛋白质全谱的完善方面做出卓有成效的研究工作。90 年代末, 已有30～35 种CSF 蛋白质通过2D-PAGE 的方法得以鉴定, 主要根据是纯化蛋白的共转移(Comigration) 、免疫染色及与其它体液的2-DE 图谱比较的结果, 有几个CSF 蛋白质已被作为大脑紊乱的诊断性标志,如 14-3-3 脑蛋白, P130 和P131 作为Creutzfeldt-Jacobs 疾病的诊断性标志[13 ] 。到了2000 年,脑脊液蛋白质组检测的技术已初具规模。Raymackers J1 等人针对脑脊液蛋白质组的检测技术作了较为全面的介绍[14 ] 。Sickmann A1 则专门就质谱仪检测之前脑脊液蛋白的分离技术进行了深一步的探讨[15 ] 。但是,人类CSF 蛋白组研究仍旧存在许多困难, 这主要由于人类CSF 内白蛋白和免疫球蛋白的数量过于庞大,造成2D-PAGE 的影像中这两者占据主导地位,并且2D-PAGE 的分析方法很少应用于脑组织中低丰度蛋白质的检测。直到几年前,仅有少数几个脑脊液神经特异蛋白质通过2D2PAGE 和MS的方法得以鉴定[8 ] 。而且,大多数被鉴定的脑组织蛋白质位于细胞浆和线粒体中,某些类型的蛋白质并未出现在2D-PAGE 的图谱中,它们中的许多具有非常重要的细胞功能,包括膜蛋白,质量非常大( >150kD) 或非常小( ≤10kD) 的蛋白及低丰度蛋白质。对于这些“疑难蛋白质”,许多科研工作者做出了卓有成效的努力。1999 年, Davidsson ,P 等人提出一种快速2-D 预备电泳法(Rapid 2D preparative electro-phoresis method) ,即液相IEF 联合SDS-PAGE 及电洗提(Electroelution) 技术去纯化足够量的选择性CSF蛋白质用以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Matrix-assisted laser desorption Pionization time-of- flight mass spectrometry ,MALDI-TOF-MS) 分析[16 ] 。Davidsson 等人用这种方法研究人类CSF 中贫量蛋白质及前额脑皮层高疏水性蛋白质, 获得56 种CSF 蛋白质及24 种前额皮层蛋白质,其中约1P3 CSF 蛋白质从未被鉴定过[17 ] 。通过这一方法,人类对脑脊液的蛋白质的了解得到充分的补充。
2. 人类尿液蛋白质组的检测
作为人体最容易得到的体液,尿液已经被广泛的研究, 用于解释生理学的一系列问题, 包括代谢、毒理及许多疾病的进程。人类的尿液是一个高度复杂的蛋白质混合物, 这些蛋白质来自血液在肾小球中的过滤产物、肾的分泌物及泌尿生殖器管道的分泌物[18 ] 。作为一种特殊的血液过滤物,尿液中的蛋白质组成类似于血液,这样,血清中占据主导地位的蛋白质——白蛋白也是尿液蛋白质中最主要的成分,因此,无论采用何种方法, 尿液蛋白组的检测结果都以白蛋白为主体。用2-DE 的方法广泛研究尿液蛋白质已有许多年了。大量的研究都将重点放在特殊疾病的标志物和毒理化学的机理研究上[19 ] 。通过这些研究, 大量的尿液蛋白质得以鉴定,但结果多为相同蛋白质的异构体或高丰度蛋白的特殊裂解产物,这说明尿液蛋白组的研究存在相当大的困难。
除了2-DE 方法外, 另一个途径就是利用液相色谱质谱LC2MSPMS(Liquid chromatography- tandem mass spectrometry) 的方法检测尿液中的蛋白质。2001 年, Chris S1Spahr 等人利用该方法,鉴定了尿液中几乎所有的蛋白质[20 ] 。在这个实验中,Chris S1Spahr 等人用Q-TOF 质谱仪( Hybrid-Quadrupole time-of-flight MS) 先将整个尿液蛋白质混合物变性、纯化、酶解, 然后利用LC2MSPMS 进行分析。为了使肽段尽可能的裂解,尿液混合物被分析处理了四次,最终鉴定了124 个基因产物(包括蛋白质和表达序列标签的翻译产物) 。有趣的是,分析这四次结果所花费的时间比单独跑一个二维电泳所需时间还要少。
3. 类唾液蛋白质组的检测
唾液(Saliva) 的蛋白质组成主要由三种唾液腺即腮腺、下颌下腺及舌下腺的分泌物决定。唾液的蛋白质分析在临床的诊断中非常重要,这主要是由于唾液为短期和长期的病理紊乱及药物治疗监控提供了一种简单、快速、无害的方法。唾液中大量的特异性蛋白已经作为临床标记物被广泛的应用, 如表型各异的α2淀粉酶在临床上作为常染色体等位基因遗传标记物以及胆囊纤维化、糖尿病的指示剂[21 ,22 ] 。但由于唾液的组成及分泌量的不同, 使唾液的收集在某种程度上受到限制。另外,目前所检测到的唾液蛋白质组成主要为富含脯氨酸蛋白质、淀粉酶、组蛋白、溶菌酶、乳铁传递蛋白、乳过氧化物酶及分泌性的IgA ,这些蛋白质几乎都来自于上述三大唾液腺, 而事实上唾液蛋白质还有一部分来自于次一级的唾液腺。
对于人类唾液蛋白质组的检测,目前涉及尚少。Y1Yao 等人直接利用二维凝胶电泳和质谱的方法检测唾液蛋白质组,最终鉴定了包括cystatins (SA-III ,SA 和SN) 、statherin、calgranulin A、白蛋白及淀粉酶等整个唾液组织中主要的蛋白质成分。鉴定的结果表明唾液组织的蛋白质成分比唾液腺的分泌物的成分更为复杂[23 ] 。Jonas Bergquist 等人则利用唾液蛋白质溶于唾液这一特点,直接用胰蛋白酶酶解正常人体的唾液组织,从而省去了分离、纯化、选择等酶切之前的处理过程。酶切后利用直接融合电喷雾离子化(direct -infusion electrospray ionization ,ESI) 将酶解产物导入一个914T 的FTICR 质谱仪( Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry) 加以分析(如图所示) 。该方法样品消耗量极少(约几毫升) , 所用的时间仅为几分钟。并且,即使样品表现出复杂的生物学特性,该方法也能提供传统的2D-PAGE 方法所不能提供的信息。Jonas Bergquist 等人同时也将该方法应用于脑脊液、尿液及血浆的蛋白质全谱的检测, 都取得了比较好的效果。[24 ]
综上所述, 蛋白组学技术虽然已经发展的相当成熟,但在人体组织蛋白质全谱的检测方面的应用仍处于起步阶段。虽然到目前为止,仅有上述三种种组织的蛋白质检测的最为全面,但是它却给我们提供了一种思路去解决类似的问题。随着蛋白质组时代的开始,人体组织的蛋白质组全谱的研究迟早会成为生命科学研究的核心和基础,并且为疾病的发生、发展及治疗提供全面的信息。虽然目前检测技术还存在许多缺陷,但我们可以利用现有的技术手段去检测人体内其他蛋白质种类和数量相对简单的组织诸如房水、泪液、晶状体、玻璃体、羊水、关节滑液及人体分泌物,甚至淋巴液、血清等等,也许对这些简单系统蛋白质组全谱研究的全面展开,会给我们未来更深入的研究工作提供更多的经验与借鉴。
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