摘要: 新近发展起来的蛋白质组学高通量技术引入到信号转导通路研究中,产生了一个新的研究领域: 信号转导蛋白质组学。其作为功能蛋白质组学的一个重要组成部分,以研究信号转导通路以及其中的信号分子改变的蛋白质组学。克服了传统地针对单条信号转导通路以及其中的单个信号分子研究策略的局限性,能够在一次实验中系统地研究多条信号转导通路中的蛋白质2蛋白质间的相互作用、蛋白质磷酸化等翻译后修饰和下游靶蛋白的改变,有助于全面阐述信号转导通路,已成为一个新的研究热点。
细胞对外界环境因素的反应,导致细胞内系列生化事件的级联放大效应,包括蛋白质的修饰(主要是磷酸化) 、蛋白质的相互作用、以及下游靶基因表达的改变等复杂事件。可想而知,细胞信号转导通路网络错综复杂,传统地针对单条信号转导通路以及其中的单个信号分子的研究策略,均存在一定的局限性,根本无法系统地、完整地、全面地阐述这错综复杂的信号转导通路网络。
蛋白质组学是在整体上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的一门学科,研究的是在不同时空发挥功能的特定蛋白质群,是从整体水平探索蛋白质的作用模式、功能机制、调节控制以及蛋白质群体内相互作用,从而揭示生命活动的基本规律。将这种高通量的研究策略引入到信号转导通路中, 产生了一个新的研究领域———信号转导蛋白质组学(简称为信号组学) 。其作为功能蛋白质组学的一个重要组成部分,以研究信号转导通路以及其中的信号分子改变的蛋白质组学。主要分为三个研究方向。
1. 研究信号转导中信号分子( 蛋白质) 的翻译后修饰
生物机体能通过对外界环境因素的变化作出反应,主要靠复杂的调控机制调节,其中大多数调控机制是由蛋白质的构象变化所介导的,而蛋白质本身的构象变化常常是通过变构效应和蛋白质一级结构的化学修饰来实现的,如磷酸化、糖基化、酰基化和遍在蛋白化等。蛋白质磷酸化/ 去磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最普遍、最重要的形式。细胞内全部蛋白质的大约1/ 3 在某一时间点磷酸化,并且主要是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化。以及大约5 %的基因编码蛋白激酶或蛋白磷酸酯酶,可见蛋白质修饰(磷酸化) 在细胞生命活动中的重要性。它是环境因子刺激或介导的信号从胞外流向胞内并导致细胞效应过程中的关键调节机制。因此,研究信号传导通路中的蛋白质分子的磷酸化或去磷酸化,已成为信号传导通路领域的前沿和热点。但由于磷酸化蛋白质大多数为低丰度蛋白质,用常规的2D 分离技术很难分离得到。因此,富集磷酸化蛋白显得特别重要。
针对蛋白质翻译后修饰主要为磷酸化,并且主要为丝/ 苏氨酸和酪氨酸磷酸化的特点,对外界因素(如: EGF、PDGF) 刺激细胞的前后的细胞提取物,使用泛抗磷酸化丝/ 苏氨酸抗体或/ 和泛抗磷酸化酪氨酸抗体,特异性沉淀丝/ 苏氨酸或/ 和酪氨酸磷酸化蛋白分子,然后进行二维凝胶电泳( two2dimensional electrophoresis , 2DE) 或一维凝胶电泳(one-dimensional electrophoresis , 1DE) 分离,比较刺激前后的图谱,从而可以获得差异蛋白质点,再用质谱技术进行鉴定,最终可以获得刺激因子(如: EGF) 介导的信号转导通路中的信号分子的磷酸化改变,即信号分子是否活化。这有助于获得某因子激活的信号分子和由此建立由其介导的信号转导通路。Pandey 等[1 ]用EGF处理HeLa 细胞,然后用泛抗磷酸化酪氨酸抗体免疫共沉淀(common immunoprecipitation , Co2IP) 酪氨酸磷酸化蛋白,一维凝胶电泳分离后,用MALDI-TOF-MS鉴定,除发现了7 种已知的EGFR 信号转导通路信号分子外,还发现新的信号分子Vav-2。用PDGF 处理也发现这个新的信号分子。Gronborg 等[2 ]采用泛抗磷酸化丝/ 苏氨酸抗体免疫共沉淀花萼海棉诱癌素A(calyculin A) (Ser/ Thr 磷酸酶抑制剂) 处理前后细胞蛋白提取物,经1DE 和质谱技术分析,发现几种已知的Ser/ Thr 磷酸化蛋白: 肌联脑蛋白1(drebrin 1) 、α-辅肌动蛋白4 (α-actinin 4) 和细丝蛋白(filamin) ,并证实了多聚腺苷酸(A) 结合蛋白-2[poly(A)2binding protein 2 ]也被磷酸化,同时也发现了一种新的蛋白质Frigg 和其上的磷酸化的位点。Steen等[3 ]采用泛抗磷酸化酪氨酸抗体免疫共沉淀EGFR信号传导通路中的酪氨酸磷酸化蛋白,经一维凝胶电泳分离, PSI (phospotyrosine specific immonium ion)scan 和质谱技术,证实了EGFR 通路中的10 种磷酸化蛋白,其中2 种为先前未证实的新蛋白质,更重要的是在SHIP22、Hrs、cbl 、STAM和STAM3 上发现了未期望的新的磷酸化蛋白质位点。可见,采用免疫共沉淀结合蛋白质组学高通量技术,有希望发现信号转导通路中的新的信号分子。
德国学者Soskic 等[4 ] 却采用了另一种研究策略,即先分别提取PDGF 处理鼠纤维母细胞前后的总蛋白质,2DE 分离后,电转移至硝酸纤维素膜上,分别用泛抗磷酸化酪氨酸抗体和泛抗丝磷酸化酪氨酸抗体为一抗,碱性磷酸酶2羊抗鼠免疫球蛋白G为二抗,进行培育。氮篮四唑(NTB) 和5-溴-4-氯-3-吲哚2磷酸(BCIP) 染色,分别获得大约260 种磷酸化酪氨酸蛋白和300 种磷酸化丝氨酸蛋白分子,至少100多种随PDGF 刺激时间的变化,其磷酸化呈剧烈变化,用MALDI2TOF2MS 和ESI 多肽序列测定,发现已知PDGF 介导的信号转导通路中的信号分子,如:ERK1、苏/ 丝氨酸蛋白激酶Akt 、蛋白酪氨酸磷酸酶Syp 和一些在其它信号转导通路的蛋白质分子,如:原癌基因酪氨酸激酶fgr ,以及一些新的信号转导分子,如:丛蛋白(plexin) 样蛋白。
除免疫共沉淀策略沉淀磷酸化蛋白外,还可以采用特异性化学基团代替磷酸基,富集分离磷酸化蛋白。Zhou 等[5 ]用巯基(sulfhydryl) 代替磷酸化蛋白上的磷酸基,用固定在玻璃珠上的碘乙酰(iodoacety)结合巯基,分离富集磷酸化蛋白,然后经过LC-MS/MS 鉴定,成功获得14 种磷酸化蛋白。Oda 等[6 ] 则采用生物素替代磷酸基团, 用抗生物素蛋白(A--vidin)2琼脂糖磁珠纯化磷酸化蛋白或肽段,用MAL-DI-MS 和ESI-LC-MS/MS 证实这种方法可以富集得到磷酸化蛋白。
2. 研究信号转导中蛋白质的相互作用
信号从胞外传递到胞内,一般均需要与细胞膜上的受体相结合,然后经受体上结合的蛋白质分子(如一些蛋白激酶) 将信号传递下去。所以受体上结合的衔接分子在信号转导中扮演十分重要的角色。通过采用抗膜受体分子抗体免疫共沉淀或亲和纯化技术(如: GST、Flag、6 ×His、TAP 亲和标签) ,可以将与受体结合的蛋白质分子一同沉淀下来,经2DE 分离、质谱技术鉴定,有可能发现和证实新的与受体结合的蛋白质分子。Kim 等[7 ] 就采用Co2IP、2D 结合质谱方法,研究与人胚胎肾细胞膜受体P2X7 结合的蛋白质分子,发现了11 种与之结合的蛋白质分子,包括: 层粘连蛋白α3 (lamininα3) 、整合蛋白β2(integrinβ2) 、β-肌动蛋白(β-actin) 、α-辅肌动蛋白(α-actinin) 、超绒毛蛋白( supervillin) 、MAGUK、磷脂酰肌醇4 激酶、受体蛋白酪氨酸激酶β(RPTPβ) 和三种热激蛋白。Kuai 等[8 ] 基于β2肿瘤坏死因子受体(LTβR) 结合肿瘤坏死因子LTα1β2 或LIGHT ,激活包括NFκB、JNK等信号转导通路,但由于受体本身没有激酶活性,其需要募集其它蛋白质分子来介导其信号转导。为了证实与LTβR 结合的蛋白质分子,采用Flag-LIGHT 处理U937 细胞,同时以不处理为阴性对照,用Flag 亲和纯化技术获得与Flag-LIGHT·LTβR 相结合的蛋白质复合体,经SDS2PAGE 分离,质谱鉴定,发现5 种与LTβR 相结合的蛋白质分子,其中的4 种为TRAF2、TRAF3、cIAP1 和Smac ,并且从中首次阐述了LIGHT·LTβR 通过募集cIAP1、Smac 介导细胞凋亡的新的分子机制。
除了受体蛋白分子可以采用此策略,信号通路中的其它分子也可以,如用来证实转录因子形成多聚体后而发挥作用。Ping 实验室[9～11 ] 研究蛋白激酶ε(PKCε) 在心脏局部缺血(ischemic) 损伤时的保护作用机制时,分别提取PKCε转基因鼠和未转PKCε基因鼠的心脏组织全蛋白,然后采用抗PKCε抗体免疫共沉淀与PKCε相结合的蛋白质分子,经2DE分离,液相色谱(LC)2串联质谱(MS/MS) 鉴定,发现了57 种蛋白质分子,其中除已证实的结构和骨架类蛋白、信号转导类蛋白和应激激活类蛋白质分子外,还发现两类未证实的蛋白质分子,分别为代谢相关蛋白和转录/ 翻译相关蛋白。这些研究表明,针对信号转导通路中某蛋白质分子的免疫共沉淀或亲和纯化,有可能将与之结合的其它蛋白质分子一同沉淀下来,通过2DE 或1DE 分离这种蛋白质复合体,然后用质谱技术鉴定,可高通量地有效研究蛋白质间的相互作用。
3. 研究信号转导通路下游靶蛋白
信号转导通路是一连串的生化和分子事件,其中的信号转导分子的抑制或加强,均将影响下游蛋白质分子的活性或导致下游靶基因的表达改变,可以从中发现信号转导通路中的下游分子。Lewis等[12 ]结合功能蛋白质组学和MKK1/ 2 的选择性活化或抑制以寻求MKK/ ERK通路的下游效应分子, 发现25 种MAPK通路下游效应靶蛋白分子,仅5 种蛋白质为以前知道的MAPK信号转导通路相关的蛋白质。这25 种蛋白质与核转运、凋亡、信号转导、DNA 修复、高尔基体组装、蛋白质降解和折叠、mRNA 转录、细胞骨架调节等相关,还有6 种未知蛋白质。Kanamoto 等[13 ]为了研究转化生长因子β(TGFβ)介导的信号转导通路的新的下游靶蛋白,其用TGFβ处理MV1Lu 肺上皮细胞,比较处理前后的2DE 蛋白质谱,获得38 种差异蛋白质,进一步用质谱技术鉴定,发现这些蛋白质分子涉及到细胞增殖、免疫反应、代谢、转录调节、DNA 稳定性和细胞骨架组分等,其中28 种蛋白质分子为新发现的TGF2β介导的信号通路中的新的下游靶蛋白分子。可见,面对信号转导通路异常,导致多个下游靶蛋白分子改变这个复杂的问题,蛋白质组学高通量技术研究策略为我们同时研究它们的变化提供了便利。
除上述蛋白质组学策略外,目前还出现了蛋白质芯片技术,可高通量地分析信号转导通路中蛋白质翻译后修饰,如磷酸化、糖基化、脂化和水解等的差异,从而筛选新的信号分子,研究蛋白质之间的相互作用,以及蛋白质与小分子物质的作用。然而,蛋白质芯片技术是一种仍在发展中的、尚未成熟的高通量新技术。
参考文献
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