陈 杰 白春学 张 敏(复旦大学附属中山医院肺科, 上海200032)
摘要 RNA 干扰(RNAi) 是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制. RNAi 是由双链RNA 触发的转录后基因沉默机制, 具有序列特异性, 在哺乳动物细胞中, RNAi 由21～23 个核苷酸组成的双链RNA 引发. 小干扰RNA (siRNA) 可以在体外合成或通过表达载体在哺乳动物细胞内合成. 由于RNAi 技术具有快速、简单和特异性强等特点, 在基因功能研究、抗病毒治疗和抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景.
关键词 RNA 干扰, 小干扰RNA , 哺乳动物
RNA 干扰( RNAi) 是由双链RNA ( double strands RNA , dsRNA) 引起的, 广泛存在于动物植物中的序列特异性转录后基因沉默过程, 是生物体在进化过程中, 抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制. Elbashir等[1 ]发现, 一种称为短干扰或小干扰RNA ( small interfering RNA , siRNA) 的RNA 干扰中间体,能在果蝇中导致mRNA 的降解.这种iRNA 为21个核苷酸, 形成19 bp 的双链RNA 分子, 3′端有2个核苷酸突出(overhang) , 可激活哺乳动物细胞的RNAi 机制.
1 RNAi 的机制
RNAi 在哺乳动物中的机制基本上与果蝇和其他低等生物中RNAi 的机制相似[2 ,3 ] . 基本步骤由启动和效应步骤构成[4 ] , 启动步骤为较长的双链RNA 经过RNA 酶Ⅲ核酸酶(Dicer) 处理后, 降解成21～23 个碱基的siRNA , siRNA与靶mRNA有高度的序列特异性. siRNA 在3′端有2个碱基突出. 效应步骤为siRNA与RNA 酶结合形成一个RNA诱导沉默复合体( RNA-induced silencing complex , RISC) , RISC 是分子质量为50 ku 的内源性核酸酶, 并与siRNA 序列互补的内源性mRNA结合, 核酸酶在siRNA2mRNA 结合体3′端大约12个碱基处切割mRNA , 使之丧失转录信息, 达到特异性抑制目的基因表达效果.
2 RNAi 在哺乳动物细胞中的应用
2.1 体外合成siRNA
如何实现哺乳动物细胞中RNAi , 目前使用得最多最广泛的是siRNA 双链复合体(depluxes) .siRNA 双链复合体是根据靶mRNA 序列设计的21个核苷酸的双链, 由一条正义链和反义链组成, 其中正义链19 个核苷酸序列与靶序列相同, 3′端有2个碱基突出, 一般为UU 或dTdT , 反义链19 个核苷酸序列与正义链互补, 3′端也有2 个碱基突出, 一般为dTdT 或UU , 3′端dTdT 结构对siRNA 双链复合体的稳定性有很大贡献, 而3′端UU结构有利于siRNA 介导的基因沉默. 研究哺乳动物RNAi 机制的学者建议, 最有效的双链siRNA 序列应该是与靶mRNA 序列互补的19 个核苷酸序列, 外加3′端2 个碱基突出构成21个碱基的双链RNA , 研究表明[3 ] siRNA 双链的反义链具有识别靶点基因序列的功能, 而正义链没有序列识别功能. 在设计双链siRNA 时, 通常将mRNA 开放阅读框区域作为作用靶点, 从启动子下游50～100 个核苷酸开始搜寻理想的靶序列. 为了避免mRNA 调控蛋白的影响, 3′端和5′端非翻译区域或者启动子不应该作为作用靶点. Tuschl 等在化学合成21～23 nt siRNA 方面的研究取得了很好的成绩[5 ] .目前已经有多家公司可以提供siRNA 化学合成服务, 比较著名的有Dharmacon (www. dharmacon.com) 、Qiagen ( www. giagen. com) 、Proligo ( www.proligo. com) 和Ambion (www. ambion. com) 等. 厂家可进行siRNA 序列设计和合成, 他们采用(AA2N19) 标准进行siRNA 设计, 即19nt + dTdT或UU , 19nt 序列基础上在3′端加2 个碱基(图1) . 研究者也可以根据自己的需要进行设计,RNA 最大合成碱基数量为80 nt , 为了防止siRNA的降解, siRNA 通常采用了碱基保护措施, 使用前根据试剂盒提供的缓冲液和步骤去保护. 采用2′2ACE 技术保护的合成RNA 冻干粉, 在- 20 ℃可以保存1 年. 另外, siRNA 的保存时间与siRNA自身序列、所采用的保护方法、保存温度等因素有关. 2p-OH 形式的RNA 可以保存6 个月. 研究表明, 以AA-N19 标准设计的siRNA , 在哺乳动物细胞中70 %～80 %有RNAi 作用.
AA-N19 设计原则: 从启动序列下游75 个碱基开始寻找第一个AA 序列, 确定AA 序列之后的19 个碱基序列为目的序列; 计算AA2N19221 序列中的G/ C 含量比值, G/ C 含量应该在30 %～70 %之间, 最好为50 %. 如果在此序列中G/ C 含量不能达到要求, 继续寻找下一个AA 序列, 直到获得满意结果. 在GenBank 表达序列标签( EST) 数据库中用BLAST 检索, 确认所设计siRNA 序列的唯一性. 如果未达到要求, 重新设计.
按照Tuschl 等设计原则[5 ] , AA (N19) TT 模式是最理想的siRNA 序列, 如果靶点基因序列中没有理想中序列, AA (N21) 或CA (N21) 序列模式可以作为siRNA 替代序列, 由于双链siRNA中的正义链并不参与靶点序列的识别, 所以正义链的设计可以用dTdT 替代.已经有多个实验室按照Tuschl 等设计原则,设计的siRNA 取得了很好的RNAi 效果. 但是从多个方面反馈的信息表明, siRNA 的设计并不一定要严格遵守AA 序列起始原则. QIAGEN 公司根据现有的研究结果和客户的反馈意见, 对Tuschl的AA 原则进行了修订和补充. 认为mRNA 21 个碱基中G/ C 含量应为50 % , 这比确定AA 起始序列更重要. 另外序列中应该避免连续同时出现3 个鸟嘌呤碱基对, 多个G 序列重叠形成的多聚体将大大减弱siRNA 的阻断作用. 以下是QIAGEN 公司的siRNA 设计原则. 第一, 在mRNA 编码区选择21 个或23 个碱基序列, 序列中GC 含量比值尽量接近50 %. 理想的GC 含量比值为45 %～55 % ,上限60 % , 超过70 %作用明显减弱. 50～100 nt的AU G启动子和50～100 nt 的终止子区域应该避免. 第二, 在一排序列中避免出现3 个以上的鸟嘌呤. Poly G 序列可以重叠, 因此形成块状结构,严重影响siRNA 的作用效果. 第三, 优先选择AA起始序列. 如果选择AA 起始, 对应的siRNA 3′端碱基突出可以为dTdT , 从RNA 合成的角度来讲,可以大大降低RNA 合成成本和增加siRNA 对核苷酸酶的抵抗性. 如果难以发现AA 起始序列和满足第一、第二条原则, 选择另外23 nt 编码区域, 继续按第一和第二条原则重新选择. 第四, 确保所选靶序列与其他基因序列没有同源性. 在GenBank中用BLAST 软件查对, 确保靶序列的唯一性. 根据客户的反馈意见, 正义链3′端的标记不影响siRNA 的效果. 依照上述原则设计的siRNA , 80 %有效. 为了确保满意的RNAi 实验效果, 建议设计2 条以上不同序列的siRNA. 上述的设计没有考虑mRNA 的二级结构. 研究表明[6 ] , 相对于反义RNA 和核酶技术, mRNA 二级结构对siRNA 的作用没有明显的影响.
体外合成的siRNA 必需导入细胞内才能诱导RNAi , 因此, 如何有效地导入siRNA , 成为研究热点之一. 研究表明, 以往在基因治疗中使用的载体可用于某些siRNA 的导入[7 ] , 目前使用最多的是阳离子脂质体载体.
2.2 细胞内合成siRNA
由于体外合成siRNA 在细胞内的作用, 受到转染技术和效率的影响, 另外体外合成siRNA 成本较高, 体内表达短暂. 因此研究者一直在寻找哺乳动物体内表达siRNA 的方法, 拓宽RNAi 技术的应用范围. 研究表明, 在体外构建siRNA 表达载体, 通过启动子诱导表达, 在细胞内产生siRNA , 触发RNAi , 是一个切实可行的方案(图2) [8～10 ] . Brummelkamp 等[11 ] 采用RNA 聚合酶ⅢH12RNA 作为启动子, 用pSUPER 质粒作为表达载体, 以DNA 为模板在哺乳动物细胞内合成siRNA , 在10 多种细胞中取得满意的抑制特异基因表达效果, 并且在细胞中表达时间长, 对细胞无毒性. 设计插入序列时, 环路结构(loops) 的大小和序列至关重要, 直接影响所得siRNA 的抑制效果. 在机制方面, 认为首先由DNA 模板产生一个stem2loop 前体, 在细胞中切割后, 变成具有功能的siRNA. 作者认为该技术是高通量筛选基因功能缺失表型的有效方法. 同样, Paddison 等[9 ]用发夹RNAs 也取得了成功. 将siRNA 序列的DNA 模板插入RNA 聚合酶Ⅲ (pol Ⅲ) 的转录单位(基于核RNA U6 或人类RNase P RNA H1 转录单位序列) .
因此利用表达载体在哺乳动物细胞内合成siRNA 是体外合成siRNA 有效的替代方案, 具有表达时间长、作用持久和成本低等特点, 更接近生物体产生RNAi 现象的自然机制, 是未来RNAi 研究的方向.
3 RNAi 与反义RNA、核酶技术的比较
反义寡核苷酸主要指一类人工合成的反义脱氧核糖核酸( antisense oligdeoxynucleotide , SODN) ,在抗病毒和抗肿瘤药物的研究中具有广阔的应用前景, ASODN 抑制基因表达的机制有多种, 最主要是与靶mRNA 通过碱基配对原则结合, 激活RNA酶H 以降解RNA/ DNA 杂交分子中的靶RNA , 阻断RNA 加工处理和翻译, 从而抑制基因表达. 反义RNA 是利用完全互补的RNA 与同源性mRNA/DNA 杂交, 封闭mRNA/ DNA , 以阻断基因表达.
核酶(ribozyme) 是一类具有催化活性的单链RNA分子(catalytic single st rand RNA) , 能通过碱基配对原则与靶RNA 结合并在特定的位点特异性剪切靶RNA , 同时兼有反义抑制效果. 反义核酸由于其作用靶点序列清楚、容易设计和制造, 被认为是极具潜力的肿瘤治疗药物, 然而在实际应用中, 由于抑制效率低, 专一性较差和较大的毒性成为目前这一方法所面临的一个现实问题, 另一方面, 用药RNAi 的大剂量、多靶点应用提供了可能.
4 RNAi 技术的应用前景
4.1 基因功能研究
在后基因组时代, 仅仅有序列已经远远不够, 在基因专利、药物开发等巨大利益的推动下, 基因功能的研究以前所未有的速度快速发展, 各种研究基因功能的新技术不断涌现. RNAi 作为一种新的、强有力的研究工具, 在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景, 使得RNAi 成为当今研究领域最引人注意的话题之一. 相对于基因敲除技术(knock out) , RNAi 具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点, 被称为基因抑制( knockdown) 技术, 是研究特定基因功能的有效方法,因此, 在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技术. 总之, RNAi 是一种有效、快捷和成本相对低廉的基因功能研究手段, 与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合, 在哺乳动物细胞基因组学功能研究中将起重要作用, 其应用前景不亚于PCR 技术.
4.2 抗病毒治疗
由于RNAi 是机体中古老而天然的抗病毒机制, HIV 病毒感染是我们亟待解决的问题, 将RNAi 技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事. 目前利用RNAi 抗病毒感染的研究已经展开, 主要集中在HIV 病毒和脊髓灰质炎病毒, 并取得了令人鼓舞的结果[12 ] . 针对HIV 病毒研究有Jacque等[13 ]设计的抑制HIV21 长末端重复序列、附件基因vif 和nef 表达的siRNA , Lee 等[14 ]针对rev 转录子设计的siRNA 及Novina 等[15 ]针对HIV 病毒gag基因设计的siRNA , 其基本策略都是选择HIV 病毒或宿主细胞基因为靶点. 然而, RNAi 治疗HIV , 应用于临床, 有几个重要问题必须解决[16 ] . a) 作用靶点的选择. siRNA 对序列要求非常严格,1 个碱基的错配, 将大大降低siRNA 基因表达抑制作用. 如果HIV 逆转录酶有较高的错配率(1/ 1 000 个核苷酸每个复制循环) , 就可能迅速导致所谓siRNA 逃逸突变的出现. 感染个体中HIV序列的多样性, 为siRNA 的设计和合成增加了难度. B) 如何有效导入siRNA. DNA 质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果, 但在原代细胞中效果较差. C)增强siRNA 在细胞中的稳定性. 为了防止细胞内RNA 酶对siRNA 的降解, 可以用DNA 质粒和病毒载体将siRNA 以发夹( hairpins) 的形式导入细胞内.
4.3 抗肿瘤治疗
多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA[17 ] . Brummelkamp 等[18 ]用逆转录病毒载体将siRNA 导入肿瘤细胞中, 特异性抑制了癌基因K-RAS (V12) 的表达. 对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果. Scherr 等[19 ]以引起慢性髓性白血病和bcr2abl 阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr2abl 癌基因为靶基因, 设计了对应的siRNA ,并获得了87 % 的有效抑制率. Wilda 等[20 ] 用siRNA 抑制白血病BCR/ ABL 融合基因表达也取得了成功. 因此基于RNAi 技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大.
参 考 文 献
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18 Brummelkamp T R , Bernards R , Agami R. Stable suppression of tumorigenicity by virus2mediated RNA interference. Cancer Cell ,2002 , 2 (3) : 243～247
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