siRNA及其在哺乳动物中的应用
来源： 浏览量：401 更新日期：2009年12月31日
摘要:RNA 干扰现象已经在多种生物中发现,但是在多数哺乳动物中尚未发现自然存在RNA 干扰的证据。因此最初RNA 干扰技术在哺乳动物细胞中的应用受到很大的限制。直到对RNA 干扰作用机制有了较深入的了解以后,主要是小干扰RNA 的发现使RNA 干扰技术在哺乳动物中的应用得以推广。本文介绍了RNA 干扰,重点描述了小干扰RNA 的发现、特点、现有制备方法以及应用。
关键词:小干扰RNA(small interfering RNAs , or short interference RNAs , siRNAs) ;哺乳动物;RNA 干扰(RNA interference , RNAi)
1 RNA干扰简介
1.1 RNA 干扰的发现 1990 年,为加深矮牵牛花( petunias) 的紫色,Jorgensen 等导入了一个强启动子控制的色素基因。可是结果与预期相反,许多花瓣颜色并未加深,反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了,Jorgensen 把这个现象命名为共抑制(cosuppression) 。1998 年,Andrew Fire 等在秀丽隐杆线虫( C. elegans) 中的研究证明,在正义RNA 阻断基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 。这种双链RNA 对基因表达的阻断作用被称为RNA 干扰(RNA interference , RNAi) 。从发现转基因植物中的共抑制现象到在线虫中明确RNA 干扰经历了近十年。随后的观察研究表明,RNAi 现象广泛存在于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、线虫、斑马鱼、果蝇、小鼠等大多数真核生物中,是它们抵御病毒的感染、抑制转座子移位的一种机制[ 1 ] 。
1. 2 RNA干扰可能的作用机制 RNA 干扰现象发现后,成为生命科学的研究热点,同时增进了对RNAi作用机制的深入了解。根据现有证据,RNAi 的机制可能是(见图1) :由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现dsRNA ,一种dsRNA 特异的核酸内切酶,即RNaseIII 核酸酶家系的Dicer 酶,能将其切割为21～23 核苷酸长的双链RNA 片段, 称为小干扰RNA ( small interfering RNAs , or short interference RNAs , siRNAs ) ; 具有核酸酶活性的siRNP ( small interfering ribonucleoprotein)与这些siRNA 构成诱导沉默复合体RNA-induced silencing complex ,RISC) ,以siRNA为模板识别同源的信使RNA(messenger RNA ,mRNA) ,siRNA 与mRNA发生链交换,释放出siRNA 中的正义链,而mRNA 则处于原先的正义链的位置;复合体中的核酸酶在同样位置对mRNA 进行切割,这样又产生了长约21223 个核苷酸的dsRNA 小片段,它们再与核酸酶形成复合体,继续对目的mRNA 进行切割,从而使目的基因沉默,产生RNAi 现象[ 1 ,2 ] 。目前一些RNAi 相关的酶或基因已在包括植物、线虫、果蝇和哺乳动物中被分离[ 3 ,4 ] 。
2 siRNA的特点及制备
2. 1 siRNA 的发现 1999 年, Hamilton 等[ 5 ] 在植物基因沉默的研究中首次发现,21～25nt 的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。随后,Hammond 等[ 6 ]进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了这些小分子RNA在RNAi 中的作用。从已发生长链dsRNA 诱导的RNAi 的果蝇S2 细胞中提取部分纯化的核酸酶,直接用于体外转染,转染后的细胞在没有长链dsRNA 存在的情况下仍然发生了特异性的RNA 干扰现象;转染完全纯化的核酸酶的细胞中却并不能引发RNAi。因此推测未完全纯化的核酸酶中所含的小分子RNA 介导了RNA 干扰。
2000 年,Zamore 等[ 7 ]把Pp-luc 基因特异的dsRNA用同位素标记,然后在一个标准的RNAi 反应中与果蝇胚胎裂解物孵育2 小时,终止反应后用丙烯酰胺测序胶分析,发现无论标记的是正义链还是反义链,目标mRNA 存在与否,都可检测到21～23nt 的RNA 小分子。反应体系中P32标记目标mRNA 的5’端,而不标记dsRNA ,反应终止后测序胶电泳分析发现mRNA 被剪切的间隔恰好也是21～23nt 。因此推测RNAi 作用过程是dsRNA 先被切割成siRNA ,然后siRNA 为模板指导核酸酶降解目标mRNA。
2. 2 siRNA 的特点 Zamore 等[ 7 ] 在RNA 干扰发生后,对目标mRNA 降解的16 个切割位点作图,不仅发现21-23nt 间隔的规律性,而且观察到其中14 个切割位点发生在尿嘧啶残基(U) 。Elbashir 等[ 8～10 ] 在果蝇裂解液中全面地分析了siRNA 的沉默效率。发现诱导基因沉默最有效的siRNA包含21-nt 的正义链和21-nt 的反义链,两端有2-nt 的3’突出。siRNA 的3’-末端2-nt 的突出对靶点识别的特异性起一定的作用,可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。2’-脱氧核苷酸代替3’突出的核苷酸,其RNAi 效果相同,但是合成时更廉价,而且可能更能抵抗核酸酶消化。
虽然RNAi 在许多生物中自然存在,例如植物、原生动物、昆虫、线虫类等,但是在哺乳动物细胞中至今未发现有RNAi 自然存在的证据。把长度超过30 个核苷酸的dsRNA 转染进大多数哺乳动物细胞中后,会导致基因表达非特异性抑制[ 11 ] 。虽然许多研究表明在小鼠胚胎干细胞和某些胚胎来源的细胞株中没有dsRNA 诱导的非特异性反应[ 12 ] ,然而在其他大多数哺乳动物细胞中,由于非特异性反应存在而无法用长链dsRNAs 诱导RNAi。
这些非特异性的反应包括激活RNA 依赖的蛋白激酶(RNA-dependent protein kinase ,PKR) 和2’,5’2寡腺苷酸聚合酶[ 12 ,13 ] : (1) 长链dsRNA 进入细胞后,细胞内的病毒防御机制被激活。细胞内干扰素产生增加,蛋白激酶PKR 被激活,活化的PKR 进一步使翻译起始因子EIF-α磷酸化失活,最终造成翻译的停滞; (2) 2’,5’2寡腺苷酸聚合酶是非特异性核糖核酸酶——RNase L 的辅因子,长链dsRNA 激活2’,5’-寡腺苷酸聚合酶,然后RNase L 又导致非特异性RNA降解。(见图2)
考虑到在线虫及果蝇中dsRNAs 被剪切成siRNA ,siRNA 又可以诱导果蝇胚胎裂解物发生RNAi ,研究人员检测了siRNA 能否诱导哺乳动物细胞内基因特异的沉默[ 9 ] 。结果发现瞬时转染siRNA 确实能够有效的诱导培养的哺乳动物细胞产生RNAi。siRNA的效率差异较大,最有效的可以减少> 90 %的目标RNA和蛋白质。最有效的siRNA 通常是21nt 的dsRNA ,并具有2nt 的3’突出。siRNA 的序列特异性十分严格,它和目标mRNA 之间一个碱基的错配会显著的减弱基因沉默[ 8 ,10 ] 。然而,这些特征并非一个有效siRNA的充分必要条件。其确切的机制尚不清楚,可能是位置效应造成的[14]。
2. 3 siRNA 的设计[ 8～10 ] 靶点通常被选择在一段cDNA 序列起始密码子下游第50～100 个碱基以后。起初认为避开5’或3’非翻译区以及起始密码子附近区域可以避免siRNP 或RISC 与上述区域结合的UTR结合蛋白,以及翻译起始复合体之间相互干扰。然而最近,选择3’-UTR 为靶点的实验表明仍然可以诱导相应的基因沉默。
在设计siRNA 时往往会选择符合AA (N19) TT(N , 任意碱基) 的一段23-nt 的基序,再从中筛选G/ C含量在50 %左右的;尽管G/ C2含量在30 %～70 %的siRNA 仍是有效的,但是有些结果表明较低的G/ C2含量的siRNA ,基因沉默效果较好。按照上述条件若未获结果,可以放宽条件,选择NA (N21 ) 结构的基序。siRNA 正义链的序列应该和(N19 ) TT 或N21 一致,即与前述两个232nt 基序中第3 至23 位碱基一致。后者正义链的3’端通常被替换成TT ,替换后siRNA 双链两端产生对称的3’突出。siRNA 反义链和23-nt 基序第1 至21 位碱基互补。因为23-nt 基序的第一位碱基不被反义链序列特异性识别,所以反义链3’末端最后一位碱基可以是任意碱基;而倒数第二位,即23-nt 基序第二位的互补碱基,应与靶点互补。另外,由于Pol III 启动子在转录的第一个碱基是嘌呤时,转录的效率最高,所以,为了适应基于Pol III 表达载体制备siRNA的方法,在设计时倾向于选择符合NAR(N17 ) YNN 的基序(R 代表嘌呤, Y 代表嘧啶) 。而对于T7 RNA 聚合酶,则要求第一个碱基是G,因此选择GN17CN2 基序。
设计siRNA 双链两端带有对称的3’TT 突出, 使无论是识别正义和反义链的siRNP 都与siRNA 双链以大致均等的几率相结合。现在认为反义链决定靶点的识别,而siRNA 正义链突出端的修饰不会影响靶点的识别,因此,无论对正义链突出端做任何修饰,对siRNA 的作用效果都没有明显影响。然而,在化学合成时,3’TT 突出可以用于明确序列的方向性。一旦序列合成订单上的序列被写成3’至5’方向时,公司可以从TT 推断该序列是否被写反了,从而及时调整、避免失误。
与反义技术或核酶不同, RNAi 作用时, 目标mRNA 的二级结构对基因沉默的效果没有太大的影响。用随机选择的针对20 个以上基因的siRNA 抑制相应基因的表达,结果发现其中只有3 个是无效的。另外两个是由于靶点处的单核苷酸多态造成的。符合前述基序要求以外, 最好用BLAST 程序(http :/ / www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/ ) 将候选的siRNA 提交到EST 数据库进行同源性比对,以便确定序列特异性。由于功效的差异,实验中最好针对每个基因制备3～4 个siRNA ,进行预实验选择最有效的一个,同时用两个不同的siRNA 做对照。如果siRNA不起作用,应该检查目标基因是否有测序错误或者多态, 抑或是选择的细胞系物种来源不对。最初的实验证明siRNA 双链内即使一个碱基的突变也足以令RNAi 失效。而且,至今未知同时用两个siRNA 干扰靶基因表达比只用一个是否更有效。我们认为是siRNA 结合蛋白的量而不是结合作用靶点的难易程度限制了基因沉默。Susan 等在一个标准的RNAi 反应中,固定基因特异的dsRNA 浓度,改变非特异dsRNA 浓度,结果发现随着非特异dsRNA 浓度的增加,基因沉默效应逐渐减弱[ 15 ] 。
Whitehead 研究所为此开发了web 界面的siRNA设计软件( http :/ / jura. wi. mit . edu/ bioc/ siRNA/ home.php) ,注册后即可免费使用。另外,Ambion 公司也提供web 界面的siRNA 设计工具(http :/ / www. ambion.com/ techlib/ misc/ siRNA-finder. html) , 但功能相对简单一些。
2. 4 siRNA 的制备 早期RNAi 相关的研究中,dsRNA基本上都是依靠化学合成, siRNA 也不例外。比较有实力从事RNA 化学合成的外国公司 包括德国Proligo (http :/ / www. proligo. com/ ) , 美国Dharmacon Research ( http :/ / www. dharmacon. com/ ) , Pierce Chemical ( http :/ / www. perbio. com/ ) , Ambion ( http :/ /www. ambion. com/ ) , Xeragon ( http :/ / www. qiagen.com/ siRNA/ ) 。国内公司生工、基康等也提供RNA 合成服务。RNA 的化学合成比较昂贵。其优点是可以在合成过程中进行标记,方便对其追踪。化学合成的siRNA 可以直接使用,但是由于分子较小,传统的用于载体转染的试剂转染效率不高。在siRNA 转染时, Invitrogen 公司的oligofectamine 试剂可获得较好的效果,被许多研究者选用。
除了化学合成以外,目前的研究中较多的使用基于载体表达的方法制备siRNA。根据研究物种的不同,可选用特异的RNA 多聚酶Ⅲ识别的启动子。目前已用于哺乳动物RNAi 研究的载体常用的启动子有T7 、H12RNA、tRNAVal 、U5 、U6 启动子等。这些表达载体,在瞬时稳定地转染了哺乳动物细胞后,可以持续的表达siRNA。可将插入序列设计成含基因特异序列的反转重复序列,它在体内表达后自发形成小发卡RNA(small hairpin RNAs ,shRNA) 。shRNA 继而被加工成siRNA 样分子,执行基因特异的沉默。载体中聚合酶III (Pol III) 启动子和一个含4～5 个胸苷的转录终止位点之间构建成多克隆位点。再利用多克隆位点把反转重复序列插入到载体中(见图3) 。转录物在转录终止位点第二个核苷酸位置终止(聚合酶III 的转录物通常缺少poly(A) 尾巴) ,然后折叠成带有3’-UU 突出的颈环结构。这一类基于载体制备的siRNA 能够在细胞内持续表达,因此可以比直接转染siRNA 更持久的阻断靶基因的表达。[16～20 ]
另一种siRNA 表达载体分别转录聚合酶III 启动子控制下编码siRNA 的正义链和反义链。这种载体产生的siRNA 也有含5 个胸苷的转录终止信号。已经出现了通过体外转录制备siRNA 的试剂盒。体外转录制备时,T7 启动子控制下分别或同时转录siRNA的正义链和反义链,然后退火形成siRNA。已知在RNAi 过程中,长链的dsRNA 会被Dicer酶切割成siRNA。因此还可以先化学合成,或体外转录获得dsRNA ,然后在体外用Dicer 酶消化,从而获得esiRNA (endoribonuclease- prepared siRNA) [ 21 ] 。
3 siRNA的应用
因为长度超过30 核苷酸的dsRNA 会非特异性抑制基因表达,RNA 干扰技术早期只能用于研究果蝇、线虫和一些植物的基因功能。在发现siRNA可以成功地诱发哺乳动物的RNAi之后, siRNA 相关研究取得一系列突破,使RNAi 技术在哺乳动物中得到了更为广泛的应用。
3. 1 基因功能研究 RNAi 技术能使基因沉默不表达或以极低水平表达,而且操作相对简便、快捷,费用也比传统的基因敲除低廉,因此是一种快速有效的研究基因功能的新方法。利用iRNAs 可以绕过抗病毒干扰素反应,在体外培养的哺乳动物细胞中达到基因敲除的效果。对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi 技术研究它的功能。
此外可用RNAi 技术阻断胚胎干细胞中某些基因的表达,研究它们在增殖和分化过程中是否起作用。国内外已报道利用鼠胚胎干细胞研究基因对发育及其它方面的功能[ 22 ] 。
在人类基因组完全测序后,面对大量功能不明的基因,需要开发可以大规模、高通量、自动化的研究基因功能的新方法。由于RNAi 能高效特异地阻断基因的表达,并且相对简便,因而RNAi 有可能成为功能基因组研究中比较便利高效的策略。可以预见RNAi 技术将对功能基因组学的研究产生巨大推动。
3. 2 医学应用前景 siRNA 转染动物细胞后,可以阻抑基因的表达,使得应用siRNA 进行基因治疗成为可能。人们已经开始尝试将RNAi 技术应用于人类疾病基因治疗的探索性研究。然而,基于siRNA 的药物应用于临床仍有许多问题需要解决,其中包括,如何使siRNA 药物在人体内导向特定的靶细胞,而不仅仅是体外实验;如何解决可能出现的毒性问题;在对机制的深入了解之前,siRNA 的特异性尚不明确。
目前抑制基因表达常采用反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争。这两种方法对基因表达的抑制都不如RNAi 高效、特异、持久。作为基因治疗的工具,RNAi 既高效特异,又简便易行。RNAi 在针对某个基因表达异常增高引起的疾病的基因治疗方面将会非常有用,如应用于抗病毒感染、肿瘤治疗等。设计病原体关键基因特异的siRNA ,靶向抑制病原体基因的正常表达,达到抗病毒的效果。研究者们将HIV21 编码的rev 基因和与它同源的dsRNA 共转染到293 细胞中, rev 基因的表达被显著抑制[ 23 ] 。CD4 基因编码细胞表面HIV 病毒的受体, 用针对CD4 的dsRNA 能将细胞表面HIV 病毒的受体表达减少75 % ,从而抵抗HIV 病毒的感染[ 24 ] 。国外一些实验室对于用RNAi 使某些肿瘤细胞系的某些癌基因沉默以观察其对肿瘤细胞生长及凋亡的影响也进行了初步的探索。CDK22 是调控细胞周期的一个关键基因,用以CDK22 为靶点的dsRNA 能阻断99. 7 %的细胞中CDK22 的表达,而在对照中只有0. 2 %的细胞中CDK22 基因的表达降低[ 17 ] 。因此可以利用这种策略治疗细胞异常增殖相关的疾病,如肿瘤。
4 结语
小干扰RNA 的发现促使RNA 干扰技术在哺乳动物中的应用成为现实。其发展与应用前景非常广阔。siRNA 研究进展的同时,在哺乳动物中已经发现了一类被命名为微型RNA micro- RNA , miRNA) 的小分子,其中有一种被称作小型临时RNA(short temporal RNA ,stRNA)。stRNA 具有和siRNA 相似的结构,也可以阻断基因的表达,只是它只在发育的特殊阶段产生,作用对象不是mRNA ,而是蛋白质翻译的起始。现有证据显示siRNA 和stRNA 有许多共通之处,比如它们相似的结构,这暗示它们的产生都有Dicer 酶的参与[ 25 ] 。总之,随着RNA 干扰技术在包括哺乳动物在内的多物种中的广泛应用,势必会帮助我们更深入的了解RNA 干扰的发生、发展、详细的作用机理等本质问题,也势必会有助于更进一步的发挥小干扰RNA的应用潜力。
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