北京大学公共卫生学院毒理学系 郝卫东
毒理学实验可采用整体动物、游离的动物脏器、组织和细胞进行。根据所采用的方法不同,可分为体内实验和体外实验。毒理学还利用限定人体试验和流行病学调查直接研究外源性化学物对人体和人群健康的影响。这些方法各有利弊,应根据不同的实验目的来选择。
实验设计是科研工作中非常关键的一步,良好的实验设计不仅是实验过程的依据和结果处理的先决条件,而且也是科研达到预期目的的重要保证。实验设计的意义在于用尽可能少的人力、物力和时间,最大限度地获得较为可靠的结果,使误差减至最低限度,并对误差大小有准确的估计,还可以使多种处理因素包括在一个或几个实验中,达到高效的目的。
合理应用统计学知识在毒理学实验中是极为重要的。实验前应在统计学指导下作缜密合理的实验设计,实验后则应将所有实验数据进行归纳整理和统计分析。恰当的应用统计方法,可以帮助我们透过现象发现事物的必然性及其本质。但是,实验方法如有错误或实验数据不够精确,或实验结果代表的是假象,那么,任何统计方法均无能为力。
此外,统计方法只是说明实验数据的差别是否有统计学意义,至于这种差别是否有毒理学意义,还必须从毒理学专业知识方面来全面考虑。
一、毒理学实验设计的基本原则
所有毒理学实验设计都必须符合随机、对照、重复三个基本原则。
(一)随机的原则
随机化( randomization)是指在抽样时,使总体中每一个体都有同等的机会被抽取;在分配样本时,确保样本中的每一个体都有同等的机会被分入任何一个组中。随机化的目的是使样本具有极好的代表性,使一切干扰因素分配到各组时只受纯机遇抽样误差的影响,而不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响。在进行毒理学动物实验时,动物必须随机分组,最常用的方法是完全随机或随机区组的方法。完全随机即将研究对象随机地分配到各个处理组中,可通过随机数字表或抽签的方式进行。随机区组即将可能影响实验结果的非处理因素均衡地分配到各组,如动物体重、性别等,具体做法是将条件相近的实验对象配成一组(配伍组) ,再将每个配伍组中的实验对象随机分配到各个处理组中。随机不等于随便、随意,在动物分组时若不采用适当的随机方法,而是抓取动物随意放在各组,不能排除动物机敏性等因素对选择动物的影响,不能满足随机化的要求。文献中常见的问题是未说明是否随机分组或不明确随机的方法。
(二)对照的原则
对照( contro1)是指在实验时针对实验组设立的可资对比的组。对照的意义在于通过对照鉴别处理因素与非处理因素的差异及处理因素的效应大小,消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等所造成的差异。毒理学实验中常用的对照形式有以下几种。
1. 未处理对照(空白对照) :即不施加任何处理措施,用于确定实验对象生物学特征的本底值,进行质量控制。
2. 阴性对照:不给要研究的处理因素,但给以其他的实验因素,以排除这些实验因素的影响。常用的阴性对照是溶剂/赋形剂对照,以此作为与染毒组比较的基础。阴性对照除了要研究的因素外,其他处理应和实验组完全相同。对照组与实验组必须在同时、同地、同条件下进行处理,否则就失去了对照的意义。文献中常可见缺乏对照、对照不全或对照不当的问题。
3. 阳性对照:用已知的阳性物检测实验体系的有效性。阳性对照组的实验因素与实验组应尽可能一致,如与受试物采用相同的溶剂、染毒途径及采样时间。对于变异较大的实验,必须设置阳性对照组。当同时进行的阳性对照组不能得到阳性结果时,说明此次实验质量有问题,全部数据无效,必须重新进行实验。有些文献中,在需要设置阳性对照组的实验(如遗传毒理学、致畸、致癌和致敏实验等)中,未设置阳性对照,或阳性对照的结果明显不合理,此时的实验结论是不可信的。
4. 自身对照:同一研究对象自身处理前后互为对照。采用这种对照时,要求研究因素处理前后的实验条件必须一致,观察指标应是稳定的。有些文献中,在实验过程中观察指标本身可能有变化的情况下,仍用自身对照,不能说明是非研究因素(如动物周龄、季节等)还是研究因素的作用。
5. 历史性对照:同一实验室过去多次实验的对照组数据组成的历史对照可用于实验室质量的控制和保证。过去的研究资料可用于研究结果的比较,但需注意资料的可比性。
(三)重复的原则
重复( rep lication)是指实验组和对照组应有一定数量的重复观察结果。随机原则能在很大程度上抵消非处理因素所造成的偏性,但不能全部消除其影响。当观测的结果具有变异性时,为了显示随机变量的统计规律性,必须有足够例数的重复实验数据。重复的原则大多数情况下通过各组适宜的样本量来体现,样本量越大,越能反映客观、真实的__情况。样本量应考虑到统计学的要求,在保证实验结果可靠性的前提下,选择适宜的样本量,以控制实验规模和成本。文献中样本量不足是常见的问题。
二、毒理学实验设计中的几个问题
(一) 实验动物的选择
实验动物( laboratory animal )是指经人工培育、对其携带微生物实行控制、遗传背景明确、来源清楚、可用于科学研究的动物。在毒理学研究中,选择合适的实验动物对于得到准确、可靠的研究结果具有重要的意义。人和不同物种的实验动物之间的毒作用在性质或毒性反应程度上表现有所不同。恰当地选择实验动物的物种,是通过外推来评价对人体毒作用的前提。实验动物物种选择的基本原则是:选择对研究因素的毒性反应及代谢特点与人类接近的物种;选择自然寿命不太长的物种;选择易于饲养和实验操作的物种;选择经济并易于获得的物种。毒理学实验常用的动物有大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、狗等,每一种动物都有其独自的特点及优缺点,实际上很难有一种动物能完全符合以上的选择原则,需要依研究目的及条件进行选择。
同一物种不同品系的实验动物对外源性化学物毒性的反应可能会有差异,所以毒理学研究要选择适宜的品系,对某种因素的毒理学系列研究应固定使用同一品系动物,以求研究结果的稳定性。
根据对动物微生物控制的净化水平,实验动物可分为无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物( SPF动物) 、清洁动物、普通动物。毒理学实验中对于大、小鼠等小的实验动物,要求至少应为清洁动物及其以上级别,用普通动物进行的实验是不被认可的。国际上, SPF动物已成为进行毒理学实验的标准实验动物。
实验动物对毒物的反应不仅存在种属差异,而且还具有个体反应的差异。因此,在选择实验动物时,还应注意个体选择。毒理学实验选用实验动物的年龄取决于实验的类型,急性实验一般选用成年动物;亚慢性、慢性实验因实验周期长,同时要观察动物的生长发育情况,应选用较年幼的或初断乳的动物。如实验对动物性别无特殊要求,一般应选用雌雄两种性别;如果已知不同性别的动物对受试物敏感性不同,应选择敏感的性别;如实验中发现毒性反应存在性别差异,则应将不同性别动物的实验结果分别统计分析。
动物的特殊生理状态,如妊娠、哺乳等对实验结果影响很大,毒理学实验一般应选用未产、未孕的雌性动物,另外,毒理学实验应选用健康动物,为确保实验动物的健康,一般需在实验前检疫观察5～7 d。
(二) 剂量分组
在毒理学实验中,最重要的就是研究剂量2反应(效应)关系。剂量2反应(效应)关系的存在是确定外源性化学物与有害作用的因果关系的重要依据。在毒理学实验中,体内实验除对照组外,一般至少要设3个剂量组;体外实验一般设3～5个剂量组,以求能得到剂量2反应(效应)关系。原则上,在剂量组设计时,高剂量组应出现明确的有害作用,低剂量组应不出现任何可观察到的有害作用(即相当于NOAEL) ,但低剂量组的剂量应当高于人体可能的接触剂量,至少等于人体可能的接触剂量。中剂量组的剂量介于高剂量组和低剂量组之间,应出现轻微的毒性效应(即相当于LOAEL) 。高、中、低剂量组的剂量一般按等比级数设置。
体外实验浓度的设计应考虑受试物在实验介质中的溶解性。对可溶性受试物,浓度高于10 mmol/L时,可因高渗透压对哺乳动物细胞引起损伤或人工假象。一般情况下,可溶性受试物的实验浓度上限,哺乳动物细胞为10 mmol/L或5 mg/ml,细菌为5 mg/平板。文献中可见仅设1个或2个剂量组的毒性实验。另外,常缺乏动物实验设置剂量与人体可能接触量关系的说明。
(三)代谢活化
在体外实验中细菌及细胞对外源性化学物的代谢能力有限,在对需经代谢活化发挥毒性作用的化学物进行研究时,应在加代谢活化系统的条件下进行实验。对于体外毒性实验的阴性结果应特别注意提供的代谢活化系统对于受试物的活化是否适合和充足。在实验中加入的代谢活化系统一般是S9混合液。S9即经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆,经9 000 ×g离心得到的上清液,由于各国禁用、限用多氯联苯,可用苯巴比妥和β2萘黄酮联合诱导制备S9。在S9中再加入一些辅助因子,如辅酶Ⅱ (NADP) 、葡萄糖262磷酸,K+ /Mg2 +及缓冲液等组成S9混合液( S9mix) ,构成还原型辅酶Ⅱ再生系统。肝S9的成分主要是混合功能氧化酶,大多数化合物在体内经过其代谢。但是,也有少数化学物是通过其他的方式活化(如1, 22二氯乙烷通过与谷胱苷肽结合而活化)或需经肠道菌丛活化,在这些情况下,应选择其他合适的活化系统。体外哺乳动物细胞实验,还可利用大鼠肝原代培养细胞等作为代谢活化系统。许多文献中,体外实验未考虑代谢活化,使对毒作用的分析不全面。
测试题
1 简述毒理学实验设计的基本原则。
2 毒理学实验中常用的对照有哪几种,各自的意义是什么?
3 简述毒理学实验中实验动物选择的原则及注意事项。
4 简述S9混合液的概念及其意义。