中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 刘秉慈
作为研究外源性化学、物理、生物等因素对生物体负面效应的科学，毒理学这门古老的科学面临着生命科学高速发展所带来的机遇和挑战。从分子水平揭示毒理学机制是当今毒理学的活跃领域，并分化出一门新的学科：分子毒理学。
目前，人类基因组计划已经完成，人类基因组学建立的方法、技术平台以及公布的DNA序列，为毒理学机制研究打下了良好的基础。分子克隆、基因导入是机制研究的常用工具。此前，目的基因的克隆与修饰常受到DNA序列不清的限制，现在则可根据已公布的DNA序列任意修饰DNA，设计分子生物学研究工具(如dominant negative mut~t)，特异地探索生物学机制。生化分子生物学的许多新技术、新方法被应用于毒理学研究之中，各种实验手册及试剂盒说明为实验者提供了十分便捷的操作程序。进一步深入了解这些技术的基本原理及应用范围，则将使我们能更灵活地运用这些方法，科学地设计研究方案。
一、印迹技术
Southera blot、Northern blot和Western blot是目前使用相当广泛的技术，前两者分别用来对特定的DNA或RNA顺序进行定性或定量的检测，如测定特定DNA顺序的拷贝数和特定DNA区域的限制性内切酶图谱，以判断是否存在DNA顺序的缺失、插入等重排现象、用末端标记的人工合成寡聚核苷酸探针检查基因的特定点突变、RNA结构的粗略分析、特定RNA顺序的定量、特定基因克隆的节选以及疾病的诊断等。
检测用已知的DNA或RNA顺序片段，称之为探针，通常是用基因克隆技术分离到的特定DNA顺序，或是在体外转录出的RNA顺序等。操作基本流程是：用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后将其转移到特异的固相支持物上，再用标记的核酸探针与之进行杂交，最后洗去未杂交的游离的探针分子。通过放射自显影等方法显示标记的探针位置或水平。
Southem blot：是Southem于1975创立的，故用Southem的姓命名。随后，依次将探测RNA和蛋白质的相应方法命名为Northern blot和Western bloto Northern blot需进行与DNA片断分离时相似的电泳过程(多为甲醛胶电泳分离RNA)，由于总RNA或mRNA是单链的，在进行琼脂糖电泳分离时，必须在有变性剂的情况下，才能防止RNA分子自身结合形成发夹形二级结构，并维持其单链线性状态。与DNA工作相比，有关RNA的分析工作具有较高的难度，这主要是因为RNA酶极其活跃，且十分稳定，因此，必须时刻注意RNA酶对RNA的破坏作用。
Western blot具有能够从混杂抗原中检测出特定抗原，或从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性，还可以对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析，具有蛋白质反应的均一性及固相膜保存时间长等优点。
二、原位杂交
原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术。它用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。基本原理是：含有互*bJ顷序的标记DNA或RNA片段(即探针)，在适宜的条件下与组织或细胞内的DNA或RNA形成稳定的杂交体。根据所用的探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA．DNA杂交、DNA．RNA杂交和RNA．RNA杂交三类。根据探针的标记物是否能直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法是将探针用放射性同位素、荧光素或某些酶标记，探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体可分别通过放射自显影、荧光显微镜术成色的酶促反应直接显示。而间接法一般都用半抗原来标记探针，并通过免疫组织化学对半抗原的定位，间接地显示探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体。
三、免疫组织化学
组织化学是采用化学、物理或生物学等试验法，对组织细胞中某些特殊反应物质、反应基团、酶促活性和免疫原性，在光电仪器下进行观察识别、定位和定量的一门技术。免疫组织化学(immunohistochemistry)是用生物学中的免疫学方法，即用发生在组织细胞的特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞内特定抗原(或抗体)的定位和定量技术。因此，免疫组织化学是组织化学的分支。为了显示和观察到组织细胞内抗原抗体反应产物，需要先将某种标记物结合到抗体分子上，然后，借标记物的荧光、酶的有色反应产物、放射性的显影或高电子密度，在光镜或电镜下进行定性、定位和定量检测。由于标记物的不同，可将免疫组织化学技术分为荧光抗体法、酶标抗体法、铁蛋白抗体法、放射性同位素标记抗体法和免疫金法。
亲和细胞化学(afinity cytochemistry)是利用2种或2种以上具有多价结合能力物质之间高度亲和而相互结合的化学。亲和细胞化学中常用的亲和物质有生物素(biotin)与抗生物素(avidin)、葡萄球菌A蛋白与IgA的Fc段、植物凝血素与糖结合物等。这些亲和物质之间不但具有高度亲和力，还可与荧光素、酶、同位素、铁蛋白及免疫球蛋白等呈化学结合，且不影响其生物活性。同免疫组织化学一样，利用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞和亚细胞水平对另一种亲和物质进行定性、定位和定量观察。亲和细胞化学是通过亲和物质问的亲和力作用，而不同于免疫组织化学中抗原抗体免疫反应。
四、基因敲除技术
基因敲除技术是目前常用的、进行功能及机制研究的重要技术。基因打靶常被称为基因定点同源重组，或基因敲除技术。实际上，基因打靶还包括基因敲入、“hit and run”及双置换等。
利用活细胞染色体DNA可与外源性DNA的同源序列发生同源重组的性质，以达到定点修饰改造染色体某一基因的目的，称为基因打靶。基因打靶可以改变基因组的组成，产生不同的生物效应，亦可中止原基因的表达，用正常基因打靶突变基因，有可能使原来突变的基因变为野生型，亦可由此引入新基因，并使其在受体细胞表达。
主要步骤：(1)重组基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上；(2)用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内；(3)用选择性培养基筛选已击中的细胞；(4)观察击中细胞的生物学特性。将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生长，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
五、RNA干扰技术(RNAi)
以基因敲除为主产生突变个体的方式，耗费较多的时间和精力。为了方便大规模的基因功能检测，需要一种快速简便的抑制基因表达的技术。1998年，由于双链RNA(dsRNA)的干扰(RNAi)对靶mRNA抑制的特异性和高效性的确认，而得到广泛重视，它的出现可帮助获得更多的基因功能信息。
2O世纪90年代，科学家将反义和模板RNA同时引入，会引起目的基因受阻时的特异表型，因此推测，模板链可能具有一定的作用。1998年Fire和他的同事们发现“dsRNA介导的RNA干扰”(RNAi)具有高效性和特异性，他们将与一段基因序列同源的反义RNA和模板RNA复性退火后注入线虫卵中，得到了明显的靶mRNA受干扰的表型，并且这种效应在线虫的后代中也能观察到。实验结果证明，双链RNA干扰mRNA翻译的效率比单纯反义或模板RNA的抑制效率提高了几个数量级。
一直以来，人们以合成的双链RNA作为外源刺激注入体内。合成方式包括体外转录和生物化学合成，但两者的导入都无法稳定地遗传。由启动子控制双链RNA表达的RNAi技术利用启动子控制一段反向序列转录，进人体内后在体内转录，产生发夹结构的双链RNA，进而引起靶基因表达的受阻。如果应用多种不同的启动子，就可控制dsRNA在特定时期、特定区域的表达，从而拓展了RNAi技术的应用空间。在大多哺乳动物中，双链RNA的引入会引发强烈的细胞毒性，导致mRNA大范围的转录停止，只有小于30 bp的dsRNA才不会引起PKR反应。在细胞内恒定表达的小型干扰RNA，例如利用多聚合成酶Ⅲ．RNA的启动子转录形成缺少多聚腺苷酸尾巴的21个核苷酸的(siRNA)在RNA干扰的引发过程中十分重要。
六、细胞杂交及单克隆抗体技术
细胞工程学是随着细胞生物学与分子生物学新技术方法的发展而新兴起来的一个新的领域，其基本概念是：应用细胞生物学的方法，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造新类型的细胞以至新品种。按照设计要求以及所要改造的遗传物质的不同，细胞工程学可分5个方面：即基因工程、染色体工程、染色体组工程、细胞质工程及细胞并合工程，其中细胞并合工程又称体细胞杂交。细胞常发生自然融合现象。1961年Barski发现，当高度恶性与低度恶性的细胞系在体外混合培养时，能自发地产生具有每一方亲代性质的杂种细胞。
以小鼠骨髓瘤细胞与用羊红细胞免疫小鼠的脾细胞进行融合，所得到的杂交细胞可以在体外培养时产生大量的抗羊红细胞的抗体，称为“淋巴细胞杂交瘤”技术。杂交瘤细胞经筛选可得到只针对单一抗原决定簇的、由单一细胞衍生的克隆细胞系，所以此技术又称为“单克隆抗体”技术。
上述分子生物学技术在毒理学中成功应用的实例很多。例如，在研究苯并芘、石英、甲醛等毒物的细胞周期、细胞信号转导机制的研究论文中，常采用反义技术、RNAi技术将相关基因(例如MAPKs等)阻断，进而采用Western blot技术分析该基因的表达水平，还可采用免疫组化方法观察这些基因所表达的相关蛋白在细胞核内外及组织中的定位改变，以确定有害因素的毒理学机制。在遗传毒物的毒性及其在体内的代谢转化、DNA损伤及其相关基因的作用，以及有害因素致病机制的研究中都广泛应用了上述常用分子生物学技术。值得提及的是，方法和技术仅仅是手段和工具，而不是目的。在对基因功能进行分析时，要逐一地正面分析并反面验证。不仅要揭示生物过程所涉及基因的种类和数量，更要揭示基因间的因果(上、下游)关系，以及这些基因是如何发生作用的(磷酸化、糖基化、分子间的结合及结合位点等)。
测试题
1 Southern blot，Northern blot，Western blot分别是针对哪些物质进行分析的?为什么用SoutIlern、Northern、Western进行命名?
2．免疫组织化学技术的主要原理与用途是什么?
3．细胞工程学的基本概念及主要方面。
原文刊于中华预防医学杂志2005年7月第39卷第4期