转基因食品的致敏性是转基因食品安全性评价中受到普遍关注的问题,与其特有的生产工艺、原料来源及产品成分有着密切的关系,与现有的食品品种比较有着显著的特征。转基因食品致敏性的检验和评价尚无统一的模式和方法。本文通过危险性评价、实质等同性分析、个案处理的原则和遗传稳定性分析、表达忠实性分析、致敏原特性及含量测定、血清学试验、动物试验等技术和方法,对转基因食品致敏性及其危害性的评价进行综述。
1 食物致敏性
1.1 食物过敏反应 食物过敏反应的一个共同特点是,必须有致敏原的预先接触即前接触,使机体处于致敏状态。当再次接触该致敏原时,才诱发变态反应〔1〕。食物过敏主要是由免疫球蛋白E( IgE)介导的速发过敏反应。其过程首先是B淋巴细胞分泌致敏原特异的IgE 抗体,敏化的IgE 抗体和致敏原在肥大细胞和嗜碱细胞表面交连,使肥大细胞释放组织胺等致敏介质,从而产生过敏反应。致敏蛋白具有对T - 细胞和B - 细胞的识别区,产生专一性的IgE 抗体。因此,致敏原含有两类抗原决定簇,即T 细胞抗原决定簇和B 细胞抗原决定簇。抗原决定簇一般为小于16 个氨基酸残基的短肽〔2 ,3〕。
1.2 致敏原的特性 1994 年,联合国经济合作发展组织(OECD) 提出了判断一种蛋白质是否具有致敏性的标准〔2 ,3〕:(1) 蛋白质具有抗蛋白水解或热变性的能力,能耐受食品加热和烹调操作,能抵抗肠道消化酶的作用。(2) 蛋白质可以或是已经发生糖基化作用,具有酸性等电点,一般分子量在10～80 kDa。值得指出的是,这些特性并不是致敏原所特有的,因为非致敏原分子同样可具有这些特性。
2 转基因食品致敏原的危险性评价
危险性评价是国际食品法典委员会(CAC) 在1997 年系统提出的用于评价食品、饮料、饲料中的添加剂、污染物、毒素或病原菌对人群或动物潜在副作用的科学程序。现已成为国际上开展食品危险性评价、制定标准和管理办法以及进行危险性信息交流的基础和通用方法。危险性评价由危害的识别、危害的特征描述、暴露量的评估和危险特征的描述等几个环节构成〔4〕。
2.1 受体生物的致敏原 受体生物是指转基因食品工程中用于接受DNA 重组体的植物、动物及微生物。受体生物为DNA 重组体的扩增和表达提供场所及条件。当转基因食品工程中应用的受体生物为致敏性生物时,受体生物的致敏原会引入转基因食品中。但由于基因工程的改造和修饰作用,转基因食品与其受体生物本身的致敏原的种类、含量及致敏性也可会有很大的不同。通过欧洲分子信息学网基因序列库EMBL 、蛋白序列库SWISSPORT ,根据对过敏性物质的蛋白质和DNA 序列的查询分类,目前已发现致敏性生物93 种,已列入各种数据库中的主要致敏原198 种。大多数已知的致敏蛋白质对消化和加工是比较稳定的,而且绝大多数主要的致敏原通常是致敏性生物中大量存在的蛋白质,除主要致敏原外,致敏性生物中还可能含有一种或多种次要致敏原〔2 ,3〕。
2.2 外源基因表达产物的致敏原 (1) 目的基因:目前在转基因食品工程中应用的目的基因已超过百种。目的基因通过在受体生物细胞内表达生物活性物质,或通过调节受体生物中某些特异基因的表达,或通过删除受体生物中某些不利的基因,实现其对受体生物表型和性状的修饰作用。有些目的基因的表达产物具有致敏性。例如,从巴西坚果中提取的2S清蛋白基因转入大豆后,产生了与巴西坚果的2S 清蛋白分子量及性质都非常相似的致敏性成分〔5〕。基因工程中调控或删除的基因,如果所涉及的基因的表达产物与致敏原有关,则可能影响产品中致敏原的种类及含量。(2) 标记基因:基因工程中常用的抗生素抗性标记基因,相当大部分来自细菌和病毒,其表达产物可能具有的致敏性是有待验证的潜在的安全性问题之一〔6〕。
3 转基因食品致敏原的实质等同性分析
实质等同性是联合国经济合作发展组织(OECD) 在1993年提出的转基因食品安全性分析原则〔5〕。实质等同性原则现已成为国际上进行转基因食品安全性评价的一个通用的模式。实质等同性分析通过转基因食品与目前市场上销售的相应原食品进行比较,发现两者在性状、成分及含量等方面的异同,以确定转基因食品及成分是否与相应的原食品具有实质等同性,为转基因食品的管理和使用提供相应的模式和方案。
应用实质等同性原则,可系统地比较和分析转基因食品的致敏原与相应的受体生物、供体生物的致敏原在性质及含量等方面的差异,为其评价和管理提供科学依据。
3.1 以传统食品生物为受体或供体的转基因食品 (1) 如果通过资料审查和信息检索,确认受体为传统食品生物。并且根据对其食用史及食用安全记录的分析,确定受体或供体生物为非致敏生物。这类转基因食品无需进行来自受体生物的致敏成分的检验和评价; (2) 通过资料审查和信息检索,确认受体或供体为致敏性食品生物。如果基因修饰作用与抑制受体生物致敏原基因的表达无关,无需进行来自受体或供体生物的致敏成分的检验。从理论上讲,转基因食品与受体生物中的致敏成分具有实质等同性。作为传统的食品生物,在长期的生产和食用过程中,人类对控制和避免其可能存在的危害因素已有了安全措施和经验;如果基因修饰作用与抑制受体生物致敏原基因的表达有关,则需进行来自受体生物或供体的致敏成分的定性和定量检验,以验证基因修饰作用的效果。
3.2 以非传统食品生物为受体或供体的转基因食品 如果外源基因的表达产物为常见的食物成分,并且与已知的致敏原无序列同源性,无需对外源基因表达产物进行致敏成分检验;如果外源基因的表达产物为非食物成分,或者外源基因的表达产物与已知的致敏原有序列同源性(两者有8 种以上相连的氨基酸序列相同) ,则需对外源基因表达产物进行致敏成分检验、动物致敏试验和血清学试验,验证其致敏性,判定该外源基因是否适用于食品。
4 转基因生物非期望效应产物致敏性的评价
非期望效应产物的致敏性是转基因食品致敏性检验和评价中一个特殊的问题。在基因工程中,由于外源基因插入受体生物的基因组,随着转基因生物的遗传分化,发生外源基因变异或基因组变异的概率会比受体生物的原基因组大幅度提高。但其变异的发生、变异的类型及变异的性质都具有极大的随机性。因此,在不同的转基因食品,甚至是采用同一受体生物或同一DNA 重组体构件的不同类型的转基因食品,其非期望效应的发生和类型也可能完全不同。采用危险性评价和实质等同性分析进行非期望效应产物致敏性的评价,往往缺乏必要的数据、信息及参照物,从而使其应用受到极大的限制。而个案处理原则可以弥补上述不足。个案处理是目前国际上用于转基因食品安全性评价的一个重要的原则,其精髓是强调产品和管理的“个性化”。尤其是在发现和确定某些不可预见的效应及危害中起到了独特的作用。通过科学的分析,发现其可能发生的特殊效应,以确定其潜在的安全性问题,为安全性评价和验证工作提供目标和线索〔2〕。
4.1 外源基因非期望效应产物的致敏性
4.1.1 外源基因的遗传稳定性分析 外源基因的遗传稳定性是指在转基因生物的遗传分化中,外源基因的分子量、核酸序列、拷贝数、整合位点和插入序列连接方式等特征性状的变异概率。外源基因的遗传稳定性决定了其非期望效应的发生和类型。通过检验样品中外源基因的上述参数,与基因工程相应的设计参数比较,分析转基因生物经过数代遗传后,其上述特征性状的改变,判定外源基因变异的发生及其变异的性质。
4.1.2 外源基因的表达忠实性分析 外源基因的表达忠实性是指在转基因生物的生长发育中,外源基因表达产物的分子量、生物活性、理化性质、含量、一级结构、二级及二级以上结构等特征性状的变异概率。外源基因的表达忠实性决定了非期望效应产物的性质。通过检验样品中目标表达产物的上述参数,与基因工程相应的设计参数比较,分析在转基因生物中外源基因表达特性及修饰性状的改变,判定非期望效应产物的性质。
4.1.3 外源基因非期望效应产物的致敏性鉴定 如果遗传稳定性和表达忠实性分析确认外源基因未发生非期望效应,这类转基因食品无需进行来自外源基因非期望效应产物的致敏性检验:确认外源基因发生了非期望效应的转基因食品,需进行下述的验证: (1) 根据外源基因核酸序列的检验和蛋白质氨基酸序列的推导结果,通过国际相关信息网,检索基因变异产物与数据库中收录的已知致敏成分的同源性; (2) 根据目标表达产物分子量和一级结构的检验结果,通过国际相关信息网,检索非期望效应产物与数据库中收录的已知致敏成分的同源性; (3) 检索认定两者有8 种以上相连的氨基酸序列相同,可判定为可疑致敏成分。对此可疑致敏成分需进行相应的致敏成分特性及含量测定、动物致敏试验和血清学试验,验证其致敏性。
4.2 受体生物基因组非期望效应产物的致敏性
4.2.1 受体生物基因组的遗传稳定性分析 受体生物基因组的遗传稳定性是指由于外源基因在受体基因组中插入导致的基因组突变的概率。基因组突变的类型有位点效应、同源抑制效应、沉默效应、激活效应及次级效应等〔5〕。例如,基因组变异可能使生物体中原来不表达的致敏成分基因发生表达或使其表达量提高,从而增加了某种新的致敏成分或改变了原有致敏原的含量。基因组的突变必然导致转基因生物的农艺性状、体细胞性状、基因组表达多态性的改变。通过检验转基因生物的上述参数,与受体生物对照,判定转基因生物基因组突变的发生及表型。
4.2.2 受体生物基因组非期望效应产物的致敏性鉴定 如果受体生物基因组遗传稳定性分析确认基因组未发生非期望效应,这类转基因食品无需进行来自基因组非期望效应产物的致敏性检验;确认基因组发生了非期望效应的转基因食品,需进行下述的验证: (1) 检验受体生物基因组突变产物的分子量和一级结构。通过国际相关信息网,检索基因组突变产物与已知的致敏成分的同源性; (2) 检索认定两者有8 种以上相连的氨基酸序列相同,可判定为可疑致敏成分。对此可疑致敏成分需进行相应的致敏成分特性及含量测定、动物致敏试验、血清学试验,验证其致敏性。
5 转基因食品致敏性检验方法
5.1 转基因生物的遗传稳定性检验 (1) 目标基因分子量测定方法〔7〕:目标基因分子量测定可有多种方法,常用的有电泳法、毛细管电泳法和质谱法。其中琼脂糖凝胶电泳法为常用的简便的方法。电泳法在提取了样品的核酸后,通过目的基因的全基因或分段扩增,以电泳检测其长度,推导分子量。用此法可分辨目标基因出现的基因丢失及缺失; (2) 目标基因序列测定方法〔7〕:基因序列测定方法包括手工测序和自动测序。由于手工测序操作复杂,测序长度一般也不够长,结果分析麻烦,且需要使用同位素进行标记,故目前常用DNA 序列自动测序。基因序列测定可以确定目标基因出现的基因变异及其类型; (3) 基因整合位点的检验方法〔8〕:提取转基因生物基因组DNA ,用限制性内切酶进行酶切,电泳后以外源插入片段的边界序列设计探针,进行Southem 杂交,割取有杂交信号的电泳条带与克隆载体进行粘端连接,筛选克隆,测定序列,可得到重组发生位点的信息;在经过数代遗传后,对重组发生区(受体生物基因组与外源基因插入片段的边界序列) 进行进一步的PCR 扩增测序,可得出外源基因整合位点的信息; (4) 转基因生物农艺性状分析方法:主要分析转基因生物的生长条件、生长速度、生长形态、产量及产物的感官性状、形态、基本元素、营养成分等; (5) 转基因生物体细胞性状分析方法:主要观察细胞特性、细胞培养条件、生长特性、细胞表型等; (6)mRNA 差异显示分析方法〔8〕:mRNA 差异显示技术利用高等生物成熟的mRNA 带有PolyA 的特性,用特异的锚定引物反转录后,再进行PCR 扩增和比对。mRNA 差异显示技术是研究基因表达产物常用的技术,该技术对基因表达的微量产物可以扩增放大。因此,能在转基因食品中微量表达产物的检测得到应用。
5.2 转基因生物的表达忠实性检验 (1) 目标表达产物生物活性的检验方法〔9〕:表达产物生物活性的检测方法因表达产物特性及生物活性的不同而异,没有固定的模式和方法。现多采用生物活性的平板扩散检测法和生物活性的生物自显影检测法; (2) 目标表达产物分子质量的检验方法〔9〕:包括凝胶电泳法、蛋白质免疫印迹法、凝胶拄层析法、超速离心法、毛细管电泳和质谱技术等; (3) 目标表达产物分离纯化方法〔9〕:包括蛋白质的提取、凝胶过滤层析、离子交换层析、蛋白质亲和层析和蛋白质的纯度鉴定; (4) 目标表达产物氨基酸序列测定方法〔10〕:包括蛋白质N 末端氨基酸序列分析、蛋白质测序的膜技术、DABITC/ PITC 手工微量测定蛋白质序列法、从cDNA 推测目标表达产物的氨基酸序列法、质谱技术测定肽及蛋白质序列法等; (5) 目标表达产物结构分析方法〔13〕:包括蛋白质组研究技术、X 射线衍射分析、核磁共振光谱分析、红外光谱分析、拉曼光谱分析、电子显微镜研究和蛋白质分子结构的计算机图像分析等。
5.3 致敏成分的特性检验 (1) 基因序列特性检验〔7〕:根据已知的致敏成分的基因序列,设计相应的引物和探针,样品抽提核酸后,采用PCR 或RT - PCR 技术扩增目标基因序列,通过凝胶电泳、核酸杂交或基因芯片技术进行鉴定; (2) 蛋白质特性检验〔9〕:根据已知的致敏成分的分子量及性质,采用抽提和层析技术,从样品中提取和纯化目标粗蛋白。经凝胶电泳和显影,显示样品中目标蛋白的条带。与蛋白质分子量标淮物、对照样品和信息检索获得的致敏成分的特性参数比较进行鉴定; (3) 消化及加工稳定性试验:通过对样品进行体外酶消化试验和加工处理试验,测定样品中可疑致敏成分对肠道消化酶及热变性的耐受能力。根据可疑致敏成分在试验中是否发生降解,即试验后的产品再经凝胶电泳和显影,是否出现相应的蛋白质条带,判定样品中可疑致敏成分的致敏原性。可疑致敏成分对消化及加工的稳定性越高,其致敏危险性越高; (4) 血清学试验〔11〕:采用单相免疫扩散试验- 琼脂或琼脂糖凝胶扩散法,或采用双向免疫扩散试验法,利用针对特定致敏原特异的抗血清为抗体,与样品中可疑致敏成分进行免疫学反应,鉴定样品中可疑致敏成分的致敏原性。血清学试验结果若为阳性,则可确认可疑致敏成分具有高度致敏危险性。
5.4 致敏成分的定量测定 对于致敏成分特性检验结果为阳性的样品,采用高效液相色谱法或毛细管电泳法,同时测定样品和受体生物中特定的致敏成分的含量。通过其含量的比较,评价产品中致敏成分含量的变化。
5.5 动物试验 (1) 动物皮肤局部过敏试验:对于致敏成分特性检验结果为阳性的样品,按《化妆品卫生规范》〔12〕中“皮肤刺激性/ 腐蚀性试验”方法进行试验和评分。通过动物局部皮肤涂敷试验,检验致敏成分对动物皮肤的刺激强度,为致敏成分的皮肤致敏反应评分,判定致敏成分对皮肤致敏反应的性质; (2) 动物全身过敏试验〔11〕:通过动物全身给药试验,检验致敏成分对动物致敏反应的强度,为致敏成分的致敏反应评定级数,判定致敏成分对动物致敏反应的性质。
6 应用实例一转巴西坚果2 S 清蛋白基因大豆致敏危险性评价〔5〕
国外某公司研发的转巴西坚果2 S清蛋白基因大豆,大幅度提高了产品中含硫氨基酸的含量,具有很高的商业和应用价值。2 S清蛋白基因的供体巴西坚果为常见的致敏性食物,有部分人对巴西坚果2 S清蛋白过敏。需对该产品进行来自外源基因表达产物的致敏性分析和评价。(1) 蛋白质特性检验:SDS - PAGE 分析证明,转基因大豆中增加了一条新的蛋白质条带,分子量为9 KD ,与常见致敏原的分子量相近。在供体巴西坚果中也有相同的条带。在非转基因大豆中没有此条带。此条带与部分纯化的2 S清蛋白的迁移速率相同; (2)血清学试验:血清采自9 个对巴西坚果2 S清蛋白有过敏史的人。分别对巴西坚果、转基因大豆及非转基因大豆的提取物进行免疫反应测定。结果表明,转基因大豆提取物可有效地与从巴西坚果中提取的蛋白质竞争结合IgE。9 份血清中有8 份与部分纯化的2 S清蛋白作用,也与巴西坚果提取物中的9 KD蛋白质有阳性反应:转基因大豆新增加的9 KD蛋白质条带也与9 份血清中的7 份作用,而9 份血清全都不能与非转基因大豆提取物中的低分子量蛋白质作用; (3) 结果判定:转基因大豆中新增加的蛋白质很可能是致敏原,具有极高的致敏危险性。据此,该产品未被批准商业应用。这是迄今为止已经公开报道的惟一被拒绝批准商业应用的转基因食品。
参考文献:
〔1 〕 付立杰. 现代毒理学及其应用[M] . 上海: 上海科技出版社,2001. 17 - 19.
〔2 〕 刘谦,朱鑫泉. 生物安全[M] . 北京:科学出版社,2001. 228 -251.
〔3 〕 聂凌鸿,周如金,宁正祥. 食物过敏原研究进展[J ] . 生命的化学,2002 ,5 :474 - 477.
〔4 〕 陈君石. 危险性评估与食品安全[J ] . 中国食品卫生,2003 ,1 :3- 6.
〔5 〕 朱守一. 生物安全与防止污染[M] . 北京: 化学工业出版社,1997. 36 - 40.
〔6 〕 贾士荣. 转基因植物食品中标记基因的安全性评价[J ].中国农业科学,1997,2 :1 - 15.
〔7 〕 邓平建,赵锦,刘建军,等. 转基因食品安全性检验的核酸检测技术研究[J ] . 卫生研究,2002 ,1 :37 - 40.
〔8 〕 卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术[M] . 北京:中国协和医科大学出版社,1999. 610 ,6944 - 697.
〔9 〕 刘建军,邓平建,赵锦,等. 转抗菌肽基因辣椒蛋白质检测技术研究[J ] . 卫生研究,2003. 2 :134 - 137.
〔10〕 汪家政,范明. 蛋白质技术手册[M] . 北京:科学出版社,2000.287 - 303.
〔11〕 孙敬方. 动物实验方法学[M] . 北京:人民卫生出版社,2001.379 - 384 ,373 - 374.
〔12〕 中华人民共和国卫生部. 化妆品卫生规范(2002 年版) . 2002 :93 - 95.
〔13〕 俞利荣,曾嵘,夏其昌. 蛋白质组研究技术及其进展[J ] . 生命的化学,1998 ,6 :4 - 9.