人类基因组计划的实施导致了基因组学(genomics) 的诞生,而其快速推进促使了功能基因组计划的开展,使得蛋白质组学(proteomics) 很快成为了一门新兴学科并得到了迅猛发展,被人们称为后基因组计划。紧接着,基于基因组学和蛋白质组学的战略和技术的边缘与交叉学科纷纷产生,毒理基因组学( toxicogenomics ) 和毒理蛋白质组学(toxicoprotenomics) 就是在基因组计划和后基因组计划的开展中相继诞生和发展起来的,并得到了毒理学家和相关学科研究者以及各国政府的重视。
1 毒理蛋白质组学的产生
毒理学( toxicology) 是研究外源性物质对生命有机体损伤作用和规律及其机制的一门学科,其内容包括确认和描述外源性物质对生物系统可能产生的有害作用和阐明其作用机制以及建立理论设想和预测评定外源性物质有害作用的危险度。毒理学作为一门应用学科,其研究水平随着生命科学的研究技术的发展而发展。在传统的毒理学研究中,对一种新的外源性物质的毒害作用研究通常以动物模型为基础,开展包括组织病理学和生物化学在内的技术研究,对其危险性评价则基于一般人群接触外源物质的平均实验数据和相关资料。虽然这些研究技术有的已比较成熟,但费时费力并缺乏高灵敏性,并且没有考虑个体的具体差异。因此在实际应用中有其一定的局限性。
蛋白质组(proteome) 原指一个细胞基因组(genome) 编码的所有蛋白质,但由于不同细胞不同时期蛋白质的表达有所差异,因此现在蛋白质组实际上是指某种组织、某个器官或某个细胞在特定时刻的所有蛋白质[ 1 ] 。蛋白质组学就是研究蛋白质组的科学,包括蛋白质的分离、性质分析和功能鉴定,蛋白质翻译后的修饰,蛋白质的相互作用以及特定时刻(如接触某种外源性物质和发生某种疾病)蛋白质表达量和翻译后修饰的变化,因此蛋白质组学可谓为一门综合的蛋白质科学[ 2 ]。
随着人类基因组计划的实施和阶段目标的完成,基因组学的研究技术有了长足的发展,由此产生的研究策略和高度发展的研究技术为其他学科的发展提供了理论基础和技术平台。毒理蛋白质组学是毒理学和蛋白质组学的交叉融合学科,是蛋白质组学在毒理学中的应用[ 3 ] 。尽管蛋白质组学和毒理基因组学自身还未得到充分发展,但毒理蛋白质组学可以认为是它们两者的融合产物[ 4 ] 。因为如同基因组学和蛋白质组学的关系一样,毒理蛋白质组学是在毒理基因组学的基础上发展而来,是毒理基因组学的延伸和拓展,也可以看作是毒理基因组学的重要研究内容。美国国家毒理基因组学中心(national center for toxicogenomics , NCT) 的研究目标之一,就是发展和应用基因表达和蛋白质组学的技术研究化学物质和药物的生物效应[ 5 ] 。
2 毒理蛋白质组学的研究内容
毒理蛋白质组学的研究包括两大互相重叠的领域: (1) 从蛋白质角度研究外源性物质对生命有机体的毒害机制; (2) 筛选特定的蛋白质作为外源性物质危险性评价的生物标志物[ 3 ] 。这两个研究领域是相互影响和相互统一的,前者是后者的基础,后者是前者的目的,其共同目标是促进人类的健康发展。虽然毒理蛋白质组学应用的是蛋白质组研究的策略和技术,但是它必须遵循毒理学的研究原则和方法来进行试验。此外,也需要全面综合而又仔细地分析结果,因此将蛋白质组学的方法与传统的毒理学技术进行比较研究同样重要。
目前,蛋白质组研究主要是对蛋白质进行分离和鉴定,而很少涉及蛋白质的翻译后修饰以及蛋白质的相互作用。对蛋白质的分离是通过双向电泳进行的,可以同时在一次电泳中分离并显示出数千个蛋白质,然后通过质谱、氨基酸序列以及氨基酸组成分析进行蛋白质鉴定。这种对蛋白质的分离和鉴定显然是高通量和高效率的,一次可以对多个蛋白质进行分离和鉴定,而不同于常规的蛋白质研究方法。应用蛋白质组学技术进行外源性物质毒性研究的策略是通过比较特定细胞、组织或器官在接触不同外源性物质的条件下蛋白质所发生的变化,然后对发生变化的蛋白质进行鉴定[ 6 ] 。
应用蛋白质组技术研究毒性机制尚处于对发生变化蛋白质的分离和鉴定阶段,这是受蛋白质组自身的研究技术限制的。当前应用蛋白质组技术研究毒性的外源性物质中主要是治疗性药物。过量服用对乙酰氨基酚(acetaminophen)导致的肝中毒是研究药物诱发的肝毒性的实验模型。以往许多研究表明,对乙酰氨基酚代谢物引起肝蛋白质的芳基化和肝中毒相关。以小鼠为动物模型,比较了服用放射性标记的药物和对照肝蛋白质的变化,通过双向电泳和质谱分离鉴定了20 多种蛋白质作为其代谢物的新的作用靶标蛋白[ 7 ] 。以不同浓度的对乙酰氨基酚和其非毒性异构体3－乙酰氨基酚(3－acetamidophenol) 处理小鼠,发现了30 多种蛋白质发生了改变,其中包括S－腺苷甲硫氨酸合成酶、硒结合蛋白、线粒体基质蛋白P1 和蛋白质二硫化物异构酶,上述这些蛋白质__的变化都是浓度依赖性的[ 8 ] 。将多种处理进行比较可以获得更多有意义的结果。例如:采用邻苯二甲酸二乙基己基酯(diethylhexylphthalate ,DEHP) 处理正常小鼠和过氧物酶体增殖体激活α受体(peroxisome proliferator2activated receptor α,PPARα) 基因敲除小鼠之后,通过蛋白质组研究鉴定了49种依赖于过氧物酶体增殖体和PPARα的蛋白质,这些蛋白质不仅参与机体的脂代谢、氨基酸代谢和糖代谢,而且也参加线粒体能量生成和应激反应。另外还发现了6 种不依靠过PPARα的蛋白质,这些蛋白将有助于发现非遗传毒性诱导的肝癌发生早期的标志物[ 9 ] 。在培养细胞中,柔毛霉素(daunorubicin) 引起了热应激蛋白60 、70 、90 表达的增强,而相应的mRNA 没有明显变化,这表明这些蛋白的表达水平的改变可能发生在转录后的翻译或蛋白质稳定水平上[ 10 ] 。此外,通过对经神经毒剂红藻氨酸( kainic acid) 处理的动物的蛋白质组分析,发现其毒性的产生涉及热应激蛋白表达改变、神经元坏死、细胞骨架结构崩溃以及线粒体结构破坏[ 11 ] 。虽然在试验中会发现多个蛋白质发生改变,通过对它们的分离和鉴定,可以知道这些蛋白质在毒性机制中扮演一定的角色,研究者也可以根据推测形成一定的理论假说,但要真正完全清楚毒性机制,必须进一步阐明这些蛋白质的相互关系。
应用蛋白质组研究技术不仅可以高通量的发现外源性物质引起的变化的蛋白质,为阐明其毒性机理奠定基础,而且可以通过筛选特异性蛋白作为毒性预测和安全评价的生物标志物。蛋白质作为细胞结构的构成者和生命功能的执行者,用其作为生物标志物方面有着DNA 和mRNA 不可替代的优越性。同时由于许多蛋白质在特定生理状态下直接分泌到体液中,因此可以直接对血液或尿进行测试,这样就可以直接方便地获取试验样品,可以大量进行蛋白质分析而不需要费时费力地收集生物解剖标本。将蛋白质作为毒性预测和危险评价的生物标志物,必需建立在对大量蛋白质进行分析的基础上, 从中筛选到特异性蛋白。对环孢霉素A (cyclosporine A) 介导的肾中毒进行蛋白质组表达图谱分析,发现肾钙结合蛋白D-8 的表达明显下降,认为其可以作为环孢霉素A 介导的肾中毒的标志物[ 12 ] 。Bandara 等[ 3 ]认为,蛋白质将在肝、肾、心血管系统毒性以及癌症发生中成为重要的生物标志物,毒理蛋白质组学将成为一种新的临床诊断前工具,并可为新药物的发现提供线索。
虽然蛋白质比DNA 和mRNA 作为危险性评价的生物标志物更具优越性,但蛋白质在基本组成上更为明显多变,更易发生次级修饰(糖基化和磷酸化) ,这些异质性给研究蛋白质带来了比研究核酸更多的技术难题。尽管如此,蛋白质作为新的标志物将比以往的标志物更为灵敏,更具有预测性,更适合新的外源性物质毒性预测和潜在危险性评价。
3. 展望:
毒理蛋白质组学作为一门新兴的交叉学科,在其研究技术和发展上都还处于一个起步阶段。在研究技术上主要受蛋白质组研究技术的限制。目前蛋白质组研究技术在微量蛋白和细胞中特定部位(如细胞膜和细胞核) 蛋白的分析还有一定的难度。对于前者可以通过一定的蛋白质富集技术,高效的蛋白质染色技术和高分辨的检测技术加以改进,如在双向电泳前,通过对红藻氨酸处理动物脑蛋白的离子交换层析发现了3 种不经样品富集处理的蛋白质[ 13 ] 。此外,应用微通道检测器可以分析细胞中微量存在的与有机磷诱导的迟发性神经毒性相关的神经毒性酯酶[ 14 ] 。对细胞特定部位的蛋白质可以在双向电泳前通过分级分离制备样品,然而对膜蛋白的分析仍有相当的难度。除了通过目前应用较多的双向电泳分离蛋白质以外,其他技术如蛋白质亲和芯片(protein affinity chip) 和抗体芯片(antibody2based chip)技术在蛋白质组研究中也得到了发展和应用。
毒理蛋白质组学作为毒理基因组学的发展和延伸,还处在落后于毒理基因组学的发展时期。应用DNA 微点阵技术研究外源性物质对基因表达的影响已经展开,并可以从中发现特异表达的基因,新的基因组技术也将不断发展来阐明毒性机制[ 15 ] 。由于基因组技术的完善与成熟及其研究的相对容易性,将基因组研究技术和蛋白质组研究技术结合起来,将会加速毒理蛋白质组学的发展[ 16 ] 。毒理蛋白质组如同毒理基因组一样,需要建立不同外源性物质的蛋白质数据库,这还有大量的工作要做[ 4 ] 。
毒理蛋白质组研究不仅可以更深层次地阐明毒性发生机制,而且可以作为新的生物标志物更为合理地进行危险性评价。毒理蛋白质组学的发展不但可以推动毒理学自身的发展,而且可以促进相关学科(如药理学、病理学) 以及药物毒性的安全评价与管理的发展[ 17 ] ,更好地为人类健康服务。
参考文献
1 Anderson NG, Anderson NL. Proteome and proteomics: new technologies , new concepts and new words Electrophoresis , 1998 , 19 : 1853-1861.
2 Kellner R.Proteomics1concepts and perspectives Fresenius J Anal Chem ,2000 ,366 : 517-524.
3 Bandara LR , Kennedy S. Toxicoproteomics 2 a new preclinical tool Drug Discov Today,2002 ,7: 411-418.
4 Spence P. Toxicoproteomics : learning to walk before it can run1Drug Discov Today ,2002 ,7 : 59-71
5 Olden K1New opportunities in toxicology in the post－genomic era1Drug Discov Today ,2002 ,7 : 273-276.
6 Fountoulakis M. Proteomics : Current technologies and applications in neurological disorders and toxicology. Amino Acids , 2001 , 21 : 363－381.
7 Qiu Y,Benet LZ ,Burlingame AL ,et al.Identification of the hepatic protein targets of reactive metabolites of acetaminophen in vivo in mice using two2dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.J Biol Chem ,1998 ,273 : 17940－17953.
8 Fountoulakis M , Berndt P , Boelsterli UA , et al. Two－dimensional database of mouse liver proteins1Changes in hepatic protein levels following treatment with acetaminophen or its non2toxic regioisomer 3－acetamidophenol. Electrophoresis ,2000 ,21 : 2148－2161.
9 Mondacald N , Chevalier S , Tonge R , et al.Quantitative proteomic analysis of mouse liver response to the peroxisome proliferator diethylhexylphthalate (DEHP) . Arch Toxicol ,2001 ,75 : 415－424.
10 Moller A , Soldan M , Volker U , et al. Two－dimensional gel electrophoresis : a powerful method to elucidate cellular responses to toxic compounds1Toxicology ,2001 ,160 : 129－138.
11 Krapfenbauer K,Berger M ,Lubec G, et al. Changes in the brain protein levels following administration of kainic acid Electrophoresis ,2001 ,22 : 2086－2091.
12 Aicher L ,Wahl D ,Arce A ,et al. New insights into cyclosporine A nephrotoxicity by proteome analysis Electrophoresis , 1998 , 19 : 1998－2003.
13 Krapfenbauer K, Berger M , Lubec G, et al1Kainic acid－induced changes in the level of low－abundance brain proteins1Eur J Biochem ,2001 ,268 : 3532－3537.
14 Richards P ,Lees J. Functional proteomics using microchannel plate detectors1Proteomics ,2002 ,2: 256－261.
15 Tennant RW1The National Center for Toxicogenomics : using new technologies to inform mechanistic toxicology. Environ Health Perspect ,2002 ,110 : A8－A10.
16 Burchiel SW, Knall CM ,Davis JW, et al1Analysis of genetic and epigenetic mechanisms of toxicity : potential roles of toxicogenomics and proteomics in toxicology。 Toxicol Sci , 2001 , 59 :193－195.
17 Snodin DJ1An EU perspective on the use of in vitro methods in regulatory pharmaceutical toxicology Toxicol Lett ,2002 ,127 : 161－168.