人类基因组计划(Human Genomic Project , HGP) 全基因组测序的完成宣告了一个新的纪元———“后基因组时代”的到来。其中功能基因组学( Functional Genomics) 成为研究的重心, 而对作为功能基因组的重要组成部分的蛋白质组学研究越来越引起人们的重视。2001 年《自然》、《科学》杂志公布人类基因组草图的同时, 分别发表了两篇述评, 即“And Nowfor the Proteome”[1 ] 和“Proteomics in Genomeland”[2 ] ,认为蛋白质组学将成为21 世纪人类最大战略资源。生物信息(BI) 、生物技术(BT) 和生物经济(BE) 将是全球经济未来5～10 年发展的重中之重, 蛋白质组学则是其中流砥柱。人类基因组计划的完成, 并没有象人们预计的那样,彻底解决基因与疾病的关系。相反,它提出了几个令人困惑的问题。第一, 人类基因组中的功能基因数大大少于预期的基因数;第二,人类基因组与酵母基因组的差异基因数仅占人类基因组的五分之一, 大大少于人类基因组与小鼠基因组的差异基因数。造成这一现象的一个主要原因是蛋白质的高度分化以及蛋白质的转录后修饰。蛋白质的表达及最终体现的功能在从转录到翻译后的多点受到蛋白的结构域的调节, 因此不能通过核酸来预测。但蛋白质能直接反映基因给予的信息, 它的表达一旦出现异常就可引发疾病。因此, 研究蛋白质的组成及性质是揭示基因和疾病连接链中的关键一环。
蛋白质组这个词的英文是PROTEOME, 它来源于PROTEins和genOME两个词的组合,意思是Proteins expressed by a genome ,即由基因组表达的蛋白质。从广义上讲, 蛋白质组是指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质, 蛋白质组学是对细胞内蛋白质组成及其活动规律的研究, 对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。从狭义上讲, 蛋白质组可以指不同时期细胞内蛋白质的变化, 比如正常细胞和异常细胞之间,细胞用药和不用药之间的蛋白质水平上的差别,这在疾病研究和药物筛选上很有意义, 也是蛋白质组在应用上最具前景的方面。
基因是遗传信息的携带者, 而生命活动的执行者却是基因的表达产物———蛋白质。基因组虽然可以在基因水平对疾病的遗传因素提供信息, 但仅此是往往不够的。一个机体只有一个基因组, 但是同一个机体的不同细胞中的蛋白质组成和它们的数量却随着细胞的种类和其功能状态而不同。基因组是生命体遗传信息的载体, 而蛋白质组是生命活动的执行者; 蛋白质组是一种全景式、动态的过程,而基因组是一个静态的过程。生命体的统一性在于基因组, 其复杂性在于蛋白质组。细胞中的基因和蛋白质并不存在绝对的线性关系, 因此人们在获取了基因的全部序列信息后必须进一步了解所有这些基因的功能是什么, 它们是怎样发挥这些功能的, 这样才能将基因的遗传信息与生命活动之间建立直接的联系, 并在蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机制、调节机制以及蛋白质群体内相互作用等。
1 蛋白质组学研究的理论基础
在不同的细胞周期、分化阶段、生长的营养状况以及环境条件下,机体内蛋白质组都会发生变化而且差异显著。从mRNA表达水平并不能完全预测蛋白质的表达水平, 因为翻译与转录丰度间无明显相关性。某些基因的mRNA 虽然丰度相同, 但翻译成蛋白质的量有几十倍的差异; 相差数十倍丰度的mRNA 可转录出相等的蛋白质量。而且体内蛋白质的合成存在动态修饰和加工, 通常并不由基因决定, 有许多细胞调节在mRNA 水平上是难以观察的, 因为许多调节是在蛋白的结构域发生的, 如蛋白质磷酸化/ 去磷酸化、甲基化/ 去甲基化等。此外,许多蛋白质只有与其他分子结合后才能显示生物学功能。因此, 只有蛋白质组学的研究才可能为细胞或组织状态提供准确而精确的分子描述。
2 蛋白质组学研究的技术与方法
蛋白质组学的特点是采用高分辨率的蛋白质分离手段, 结合高效率的蛋白质鉴定技术, 全景式地研究各种特定情况下的蛋白质谱。蛋白质组研究技术包括蛋白质的分离技术和蛋白质的鉴定技术。
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D - PAGE) 的发展使得对蛋白质混合物的分离达到可重复性和高分辨率, 这使得定性和定量分析细胞或组织标本中的蛋白质成为可能。二维凝胶电泳基本原理在于一维分离是以电荷差异为基础, 而二维分离是以蛋白质分子量不同为基础。经过蛋白样品变性、等电聚焦分离、固定pH梯度凝胶条( IPG) 上泳动, IPG上将出现不同蛋白质带。此胶
条再置于含SDS 的聚丙烯酰胺凝胶上, 根据分子量大小而分离。分离后的蛋白质条带通过差减处理, 可展示不同来源的蛋白样品间的差异。但令人遗憾的是,2D - PAGE 本身是一种重要的描述性技术, 当分离后的蛋白质缺少快速和可靠的鉴定工具时,其在蛋白质研究中的应用是有限的。20 世纪70 年代随着软电离技术ESI(电喷雾电离) 和基质辅助的激光解析电离化飞行时间质谱( matrix assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrum, MALDI-TOF-MS) 技术的出现, 质谱成为现代蛋白质科学中最重要和不可缺少的部分。
MALDI-TOF-MS 技术是将样品和小分子的基质混合在一起, 基质包围在样品周围, 经过激光脉冲辐射使被结合的蛋白质解析形成荷电离子,根据不同质荷比,这些离子在真空场中飞行的时间长短不一,由此绘制出质谱图进行分析。自从1993 年,美国的Bill Hutchens 和Tai-Yung Yip[3 ,4 ]提出了改良的表面加强的激光解析电离化飞行—时间质谱(Surface enhanced laser desorption ionization-time of flight mass spectrum, SELDI-TOF-MS) , 使蛋白质的分离技术又上了一个台阶, 这一技术中的主要技术———蛋白质芯片系统(Ciphergen ProteinChip Biosystem
Inc. , USA) 在研究疾病发生的机制、疾病治疗药物药靶的选择、药物毒物代谢及动力学研究上有了大量的应用。
3 蛋白质组学研究较理想的技术平台
3. 1 SELDI 技术简介
SELDI技术的基本原理是基于特殊芯片表面加强的吸附[5 ] 。芯片表面的基团有两种: 化学的(如亲水基团、疏水基团、离子基团) 或生物的(如金属离子、抗体、受体、配体) [6 ] 。复杂的生物样品(如细胞或体液) 中的特定蛋白质通过特定的芯片表面被吸附在芯片上。在洗脱除去弱结合的蛋白质后, 加上能量吸收分子(energy absorbing molecular , EAM) , 利用激光脉冲辐射使被结合的蛋白质解析形成荷电离子,根据不同质荷比,这些离子在真空场中飞行的时间长短不一,由此绘制出一张质谱图,可以直接显示样品中各种蛋白质的分子量、含量等信息。若将它与正常人或某种疾病患者的图谱,甚至基因库中的图谱进行对照,就能发现和捕获新的特异性相关蛋白质[7 ,8 ] 。SELDI 技术的优点在于可以高通量、高效率地对少量未经预处理的样品进行分析。实验重复性好, 敏感性高, 价格低廉,适用于临床诊断及大规模人群筛查[9 ] 。
3. 2 SELDI 技术与传统蛋白质组学研究方法的区别
以往, 有关蛋白质的研究多采用色谱分离纯化、二维电泳、光谱、质谱定量定性等分析化学的研究技术。运用这些手段进行研究所必需的技术条件要求高, 仪器昂贵, 步骤繁琐, 耗时冗长, 不适应大规模的人群筛查和临床检验。SELDI技术与MALDI技术的根本区别, 即它的优点是蛋白质先和芯片表面物质结合, 再加上基质, 因此获得的图谱更单一, 重复性好, 可用于MALDI所不能进行的蛋白质定量分析[10 ] 。另外, SELDI 技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化,因此可用于分析复杂的生物样品[11 ] 。
与2D-PAGE 相比,SELDI 技术的优点在于:第一,SELDI 技术可以分析2D-PAGE 无法分析的蛋白质, 包括疏水性蛋白质, p I值过高或过低的蛋白质, 以及低分子量的蛋白质( < 25 000 ) ;第二, 在未经处理的样品中, 许多被掩盖的低浓度蛋白质可以通过SELDI 技术被发现, 增加了发现生物标志物的机会; 第三,SELDI 技术只需少量样品,在较短时间内就可以得到结果,且实验重复性好, 适合临床诊断及大规模筛选疾病相关生物标志物。
4 SELDI-TOF-MS 技术在公共卫生学领域中的应用
蛋白质芯片技术和SELDI 技术在识别特定蛋白质的表达物、进行蛋白质水平药物筛选、揭示蛋白激酶的作用、测定血清中的小分子物质含量等方面均证实较现有技术更准确迅速。它具有相当高的敏感性和微量的定性分析能力, 因此对疾病尤其是癌症的早期发现具有重大的意义, 比传统的检测技术先进得多。目前,SELDI 技术在发现和定量分析疾病标志物方面取得了一系列突破性发展。
4. 1 肿瘤早期检测和预防
用SELDI 技术比较正常和病变样本, 可以进行差异蛋白的研究,寻找肿瘤的标志物,进而用来诊断未知样本,早期检测肿瘤的发生[12 ～15 ] 。目前采用SELDI 技术对卵巢癌患者血清进行筛查[16 ] ,其灵敏度为100 % ,特异性为95 % ,阳性预测值为94 %。乳腺癌的常规检查方法为乳房X线照相术,其敏感性为75 %～90 % ,特异性为75 %～90 % ,阳性预测值仅25 %。仅50 %的乳腺癌病人可在原位癌时被诊断。有研究者用SELDI 技术结合金属螯合Ni 型蛋白质芯片对乳腺癌进行分析[17 ～19 ] , 其诊断准确率100 % , 特异性96 %。用该特异蛋白制成的NMP66 试剂盒有望作为一个新的乳腺癌诊断方法用于临床检验, 真正达到早期诊断、早期治疗和预防的目的。上海市疾病预防控制中心研究人员用SELDI 技术从80 名肺癌患者和85 名的健康人血清样品中成功筛选出3 个肺癌早期生物标志分子, 为肺癌诊断技术的发展提供了关键性的基础, 将大大改变目前对肺癌患者的临床检测, 希望能够在人体甚至细胞未出现任何形态学改变, 仅从蛋白质的变化中即可检测出癌变前兆, 从而对肺癌高危人群从行为、生活方式等方面进行干预,以预防和控制肺癌的发生。
4. 2 毒物、药物蛋白质组学
应用SELDI-TOF-MS 技术可以进行毒物及药代动力学研究。如将毒物剂量、服药后不同时间的血样取出,与固定的相应配基反应,纯化质谱分析,因峰值与剂量相关,通过质谱定量即可得出毒物剂量- 效应(反应) 关系及药物药代动力学曲线。Carmen MA 等[20 ]学者应用SELDI 技术对硫代芥子酸对人IL-6 的毒性效应进行研究,由于蛋白质芯片高通量、大规模的特点,从而快速找出了其毒性作用机制, 这对于疾病的治疗、毒物毒性评价意义深远。
4. 3 其他疾病的治疗和预防
美国科学家Davad He 利用SELDI 技术发现了爱滋病抑制白,从而为爱滋病的发病机制、治疗与预防提供了新的思路。
5 SELDI-TOF-MS 技术及蛋白质芯片的发展与预测
SELDI 技术的问世,提供了一个有效的分析手段。不仅可在临床医学领域用于发现生物标志物, 研究药理学, 观察治疗预后效果; 还可在基础研究领域用于研究蛋白质的修饰, 蛋白质__间相互作用,信号传导和酶促调节等[6 ,21 ] ,从而实现了在蛋白水平直接大规模进行基因功能的研究。传统意义上的蛋白质芯片是检测蛋白质之间即已知蛋白的抗原抗体之间相互作用的生物芯片,而SELDI 蛋白芯片技术不仅可检测已知蛋白,同时可用来发现疾病的未知特异蛋白, 从而研制出相应的蛋白芯片。这种蛋白芯片可同时检测多种疾病相关基因或蛋白,从而对遗传病、肿瘤、传染性疾病进行辅助诊断。随着它的发展,最终将成为恶性肿瘤以及人类其他疾病机制研究和防治中的有力武器, 对疾病的早期诊断和疗效监测等产生巨大的推动作用。同时, 在其他相关领域,如环境保护、食品卫生、生物工程、工业制药等方面也将具有广阔的应用前景。
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