摘要: 睾丸生精细胞存在着自发性和化学物质诱发性凋亡。现代工业造成大量污染物涌入环境中, 而这其中许多物质被证实具有生殖毒性,能够影响机体的生殖和发育。这类污染物被归属为内分泌干扰物( EDCsPEDs) 。研究EDCs 所诱导的生精细胞凋亡将丰富和拓展其甄别的依据及其途径,并对作用机制提出新的阐述,在生殖毒理学领域、男性生殖方面具有重要现实意义。
现代工业带来了繁荣与进步,然而环境污染也接踵而来,大量污染物涌入环境中,造成生态平衡的破坏。1936 年Dodds 等就发现羟基联苯化合物具有雌激素活性,导致多种雄性野生动物生殖发育异常, 经调查分析认为环境中的化学性污染物是导致上述生殖发育异常的元凶。研究发现,许多有机农药可以与大鼠以及人类的雄激素受体结合,并可以在离体和在体的情况下阻止产生大鼠雄激素的基因表达,导致大鼠的青春期延迟,性腺缩小,性分化改变。美国环保署(EPA) 将这类化学性污染物归属为内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicalsPendocrine disruptors ,EDCsPEDs) 。从被干扰的内分泌系统来看, EDCs 的危害似乎主要集中在雌激素干扰物上。不同的干扰物又循不同的途径导致生殖系统尤其是生殖细胞的损害, 其中, 对生精细胞凋亡的失衡与EDCs 关系的研究成为新的研究热点,本文就此作一综述。
1 生精细胞凋亡的相关因素
1. 1 睾丸生精细胞凋亡相关的基因 与睾丸生精细胞凋亡相关的基因大致有: ①FasPFasL 。Richburg等[1 ] 发现, Fas 定位于睾丸生精细胞,而FasL 在支持细胞中有大量表达。而且FasPFasL 随着单2(2-乙基己基) 邻苯二甲酸盐[ mono-( 2-ethylhexyl )-phthalate , MEHP] 、2 ,5-己二酮(2 ,5- hexanedione , 2 ,5-HD) 等毒性作用的增强而表达增强。许多具有生精细胞毒性的物质是通过FasPFasL 诱发睾丸生精细胞凋亡的。Fas 系统作为支持细胞和生精细胞之间的信号传递途径,通过旁分泌机制在生理性和化学物质诱导性凋亡中起到了关键的作用。②B 细胞淋巴瘤-2 (B cell lymphoma-2 ,Bcl-2) 基因。③Bcl-2 相关X蛋白(Bcl22 associated X2protein , Bax) 。④原癌基因c-myc 。⑤环腺苷酸反应成分调节子(CAMP responsive element modulator , CREM) 。⑥热休克蛋白70(heat shock protein-70 , HSP70) 。⑦骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein , BMPs) 。⑧p53 。⑨c-kitPSCF , c2kit 是一种酪氨酸激酶受体,属于血小板生长因子受体家族,调控血细胞生成及生殖细胞发育。
1. 2 导致生精细胞凋亡的其他因素 主要有辐射、微波、氧化应激、高温、营养、血2睾屏障破坏等。
2 生精细胞凋亡与EDCs 的关系
尽管环境内分泌干扰物会引起雄性生殖系统的各种形式的异常,但其引起生精细胞凋亡的机制显然是多样的。以下是一些常见的EDCs 引起生精细胞凋亡机制的研究结果。
2. 1 烷基酚(alkylphenols) 工业上烷基酚被用做树脂原料,其中壬基酚还被用做非离子型表面活性剂,如非离子型洗涤剂烷基酚聚乙氧基化合物,被广泛用于洗涤剂、乳化剂和造纸工业。
2. 1. 1 辛基酚(42tert2octylphenol ,OP) Raychoudhury 等[2 ] 发现烷基酚,包括OP 都属于环境污染物。对成年大鼠给予OP 可损害精子的生成,并显示具有对哺乳动物和水栖动物的离体脾细胞的毒性。体外培养成年大鼠的混合生精细胞并给予10 - 8molPL 的OP 或19～21 d 大鼠的支持细胞给予10$12molPL OP , 但不给予0. 08 %乙醇(载体) 或者10 - 6molPL 的17β-雌二醇或者地塞米松, 24 h 后活性细胞的百分率显著减少,而经过这些处理后细胞总数并没有明显的减少。对生精细胞的流式细胞术分析显示,暴露于10 - 4或10 - 6 molPL OP 将导致异倍体的产生。给予4h 10 - 6 molPL OP 的处理,但不给予10 - 6molPL 的17β-雌二醇或者地塞米松,吖啶橙染色后观察发现支持细胞染色质明显凝聚。而在含Ca2 + 培养液中, 24 h暴露于10 - 6molPL 的OP 后导致活性细胞所占的百分率持续降低。而支持细胞在10 - 6 molPL 的OP 中培养24 h (不给予雌二醇和地塞米松) 后,显微镜下发现核缩小和DNA 3P-OH 端的某种改变。这些结果证明OP 而不是雌二醇和地塞米松对支持细胞和生精细胞有直接毒性,这种毒性是通过非Ca2 + 依赖性的凋亡实现的。OP 能对体外培养的大鼠生精细胞和支持细胞产生直接毒性,诱导支持细胞的过度凋亡[3 ] ,从而间接导致生精细胞凋亡。
2. 1. 2 壬基酚(nonylphenol ,NP) Hughes 等[4 \ ]研究表明,环境中的工业污染物烷基酚可能充当外源雌激素而影响睾丸发育并导致男性生育力的降低, 在这些化合物的靶细胞中,支持细胞最易受到影响, 他们证明肌内质网Ca2 + 2ATP 酶2 和3 在大鼠的睾丸微粒体膜、肌样细胞、支持细胞、TM4 细胞(从初生小鼠支持细胞分离培养得来的1 种细胞系) 中相对丰富,许多烷基酚如NP、OP、双酚丙烷(bisphenol A , BPA) 、丁羟甲苯均可在微摩尔的低浓度范围即抑制睾丸内细胞的Ca2 -ATP 酶,干扰睾丸的Ca2 + 平衡。Kwak 等[3〗分别给予雄性剑鱼NP、BPA 以及它们的混合物,流式细胞计数分析和末端脱氧核糖核酸转移酶( TUNEL) 测定均显示睾丸的生殖功能受到损害。组织病理学分析发现暴露于NP 后精曲小管的细胞凋亡,受损睾丸的精子发生受到明显抑制。
2. 2 MEHP MEHP 是1 种被广泛研究的支持细胞毒物,Richburg 等[5 ] 研究发现,Fischer 大鼠给予MEHP 后,出现支持细胞波形纤维蛋白细丝分布的改变和生精细胞的凋亡,MEHP 可以导致支持细胞的波形纤维蛋白细丝萎缩,用TUNEL 法观察睾丸冷冻切片,证明有大量的生精细胞凋亡。而生精细胞的凋亡可能是由于MEHP 导致的支持细胞功能障碍引起了生精细胞的凋亡。在进一步的研究中,发现Fas系统参与调节睾丸生精细胞的数目,启动MEHP 暴露后引起的生精细胞凋亡,在支持细胞对抗生精细胞损伤诱发凋亡中有特殊的活性[6 ] 。Dalgaard 等[7 ]也指出MEHP 并非通过雄激素受体发挥作用,而是与支持细胞波形纤维蛋白细丝局限化以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶23 (caspase23) 的活性增高有关。
2. 3 乙醇 乙醇不仅在工业中被广泛用作有机溶剂,而且在日常生活中也会被广泛接触。慢性乙醇暴露以及乙醇成瘾者会干扰下丘脑-垂体-性腺轴, 影响支持细胞的分泌功能,发生睾丸萎缩和不育[8 ] 。Emanuele 等[9 ] 以青春期前雄性大鼠为模型建立乙醇混合流食组和等热量食物对照组,前者的FasL 在睾丸组织中的表达增加,睾丸生精细胞的DNA 断裂增多,精原细胞和精母细胞凋亡增加,结果表明睾丸内脂质过氧化物、氧化型谷胱甘肽增多,乙醇对大鼠生育力的损伤可能是通过睾丸氧化损伤的介导来加速生殖细胞的凋亡。Zhu 等[10 ] 用TUNEL 法检测到乙醇饲养大鼠的精原细胞和精子细胞都有显著凋亡睾丸中FasL 增加, p53 mRNA 的表达水平升高。所有这些都表明乙醇对睾丸生精细胞具有促进凋亡的作用。
2. 4 乙二醇甲醚及其代谢产物(ethylene glycol mon-omethyl ether , EGMEPMAA) EGME 也是在工业中广泛应用的有机溶剂,在人工晶体材料中也有应用。Wang 等[11 ] 发现酪氨酸激酶pp60 在支持细胞和生精细胞的相互作用中起传递功能,并且可能是EGMEPMAA 导致的生精细胞凋亡的重要因素。Jindo 等[12 ]的发现也证实了EGME 通过抑制激酶活性从而使精母细胞凋亡。Watanabe 等[13 ] 发现EGME 暴露可引起睾丸和附睾的重量显著减轻,以及粗线期的精母细胞凋亡。Wang 等[14 ] 还发现在精母细胞凋亡之前就已有6 种基因的表达增强,它们分别是睾丸复合基因1 (t2complex testis expressed gene 1 , tctex1) 、基因编码核糖体蛋白( gene encoding ribosomal protein , S25) 、tctex2、α22 ,6 唾液酸转移酶基因(alpha-2 ,6-sialyltransferase gene) ,以及两个未归类的睾丸基因表达序列。
2. 5 重金属 重金属进入人体后能破坏血-睾屏障, 导致支持细胞紧密连接的断裂及其细胞内微管、微丝的异常聚集。重金属等物质进入到精曲小管内,可作用于睾丸支持细胞、间质细胞,导致精子发生所处微环境产生变化[15 ] 。
2. 5. 1 镉 镉能通过抑制p53 基因表达从而导致睾丸生精细胞凋亡,Xu 等[16 ] 应用RT2PCR 技术检测到镉暴露小鼠的睾丸p53 基因表达与镉暴露剂量呈明显负相关。镉能引起睾丸生精细胞的凋亡。在给予镉后开始的24 h 内,施以镉的螯合剂可以全部或部分抑制睾丸细胞DNA 凋亡性变化。给予镉的螯合剂能调整体内凋亡的进程。但螯合剂的影响是直接作用于凋亡,还是螯合剂通过与镉的螯合而降低了镉对睾丸细胞的有害剂量从而影响了凋亡, 目前仍不清楚。镉介导的凋亡使细胞间Ca2 + 浓度失控, 从而激活了核酸内切酶的活性[17 ] 。加大所施予大鼠镉的用量,Cd2 + 激活Ca2 + 依赖性核酸内切酶的作用加强,导致睾丸细胞凋亡。研究证实镉通过钙通道进入睾丸细胞,这一事实支持了镉作用于钙自稳态的假说[18 ] 。而且镉也会导致支持细胞、间质细胞的凋亡[17 ] 。
2. 5. 2 汞 有机汞和无机汞均可透过血-睾屏障, 抑制胸腺嘧啶脱氧核苷、尿嘧啶核苷及L-亮氨酸合成,从而干扰生精细胞内DNA、RNA 和蛋白质的合成[15 ] 。Homma-Takeda 等[19 ] 用TUNEL 法检测到雄性Wistar 大鼠暴露于氯化二甲基汞后,其血浆内睾酮减少, Ⅶ～ Ⅷ期的精母细胞和Ⅸ～Ⅺ期的精子细胞对损害最为敏感。结果显示,氯化二甲基汞对精子发生的损害主要是通过特定阶段的生殖细胞凋亡产生的。
2. 5. 3 铅 铅是常见的工业毒物,在电池的生产中被广泛应用。Adhikari 等[20 ] 应用单层生精细胞与支持细胞的共培养模型研究铅对生精细胞的毒性, 结果发现随着时间和浓度的增加,支持细胞逐渐减少, 生精细胞可能通过逐渐与支持细胞失去连接而失去支持,发生凋亡。
2. 6 苯并芘[ benzo (a) pyrene , BaP] BaP 是芳烃化合物,广泛存在于香烟烟雾和车辆尾气中。Revel等[21 ] 发现BaP 通过激活芳烃受体、酶的诱导和DNA加合物的形成,导致生精细胞的凋亡。
2. 7 植物性雌激素(phytoestrogen) 植物性雌激素常见的有大豆异黄酮、拟雌内酯、金雀异黄素、黄曲霉素等[22 ] , 在大豆、绿茶中都有分布。Kumi-Diaka等[23 ] 运用TUNEL 法探测细胞凋亡过程中产生的DNA 碎片,发现金雀异黄素可以导致睾丸细胞的凋亡,并且各种细胞对其敏感性不同,和剂量-暴露时间呈正相关。但是植物性雌激素并不会造成蓄积, 生物半衰期短。
3 EDCs研究的展望
目前EDCs 的研究主要集中在: ①EDCs 对生殖系统形态和功能的影响[24 ] ; ②鉴别和判定甾族化合物和合成类化合物是否具有潜在的内分泌干扰功能; ③ EDCs 在分子水平上的作用机制; ④自然界中的植物性雌激素应该和EDCs 区别对待,如大豆异黄酮。将来的研究应该集中在EDCs 的相互作用上。很明显,随着研究的深入,传统毒理学的阈值正在受到挑战。而且以往所认为的EDCs 作用的类雌激素机制也有新的思考,还有相当多的环境污染物对于生殖系统影响的机制不明。由于EDCs 具有蓄积和生物放大作用, 因而它们的影响是长期的。EDCs 对于人类以及自然界其他的大量物种的影响也表现出遗传易感性,长期暴露于EDCs 而引起的适应性的基因改变也将重新编码甾体受体[25 ] 。作为一个全球性的问题,需要长期的观察并加强对环境EDCs 的筛选,而结合对EDCs 引起的生精细胞凋亡和生精细胞凋亡所表现出来的生殖毒性的研究, 将丰富和拓宽环境EDCs 甄别的依据以及途径。
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