摘 要:微核试验是反映染色体损伤的重要试验方法,已广泛应用于遗传、食品、药物、环境等多领域的遗传毒性评估,以及作为有害职业和生活环境暴露人群遗传损害的生物标志物。我国开展微核试验已有二十余年的历史,本文通过检索《中国生物医学文献数据库》(1980～2000) ,共检索到有关微核的专题研究文献共1316 篇,研究内容涉及微核的文献共2083 篇。本文对微核的相关信息进行了分析,并结合作者自己的研究工作,回顾了微核试验在中国的应用和发展,总结了我国学者开展该项工作的优势与不足,对微核试验在我国的进一步发展进行了展望。
1 微核试验简介
微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体,主要由外界损害因素(生物的、物理的、化学的) 作用细胞后,导致细胞染色体丢失或断裂,从而在胞浆中形成1 个或数个小核[ 1 ] 。因此,微核试验在对外来化合物(如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染物等) 遗传毒性检测方面,得到了广泛应用。同时,该方法在职业暴露人群遗传损害监测和现场生态环境检测方面,也得到了大量的应用。微核试验最大的优点是经济、简单、快速,而国内外大量的对比试验研究,比较一致的看法是该方法在敏感性、特异性和准确性方面,与经典的染色体畸变分析方法基本相当[ 2 ] 。因而,特别适合作为大量化合物和现场人群初筛的实验方法。
微核试验创建于20世纪70年代中期(1973～1975) [ 3～4 ] ,目前许多国家和国际组织,已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理安全性评价的必做试验[ 5～8 ] 。近年来,随着分子生物学技术的迅速发展和渗透到微核研究中,大大拓展了微核试验的检测和应用范围,已发展成为能同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、不分离、DNA 损伤修复障碍、Hprt 基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传损害终点,因而近年来国际上有人提出了新微核试验(new micronucleus test) 概念[ 9 ] ,从而使微核试验焕发出新的生机。
2 从文献数量分析看微核试验在中国的应用和发展概况
我们系统检索了中国医学科学院情报所编辑的《中国生物医学文献数据库》(1980～2000) 。共检索到有关微核专题研究文献1316 篇(含综述) ,研究内容涉及微核的文献2083篇,从文献数量上来看,反映出微核研究在我国已具有相当的广度。
从我们掌握的资料来看,我国有关微核的第一篇报道发表于1978 年,是中国科学院云南动物研究所有关用人外周血分离淋巴细胞,研究辐射诱导的淋巴细胞微核率[ 10 ] 。其后薛开先、钟宝珍、黄进忠等一批学者[ 11～13 ] ,在八十年代前后开始涉足微核研究。我们对1980～2000 年微核文献逐年进行了检索,其文献分布见图1 。从图1 有关微核专题文献可见,我国微核论文数量大致可分为四个阶段:1980～1983年间保持在每年30 篇以下的水平。1984～1993 年的10 年间在每年30～60 篇之间波动。1994～1998 年的5 年间形成一个高峰,每年微核文献大于100 篇,而1999～2000 年又呈迅速下滑趋势,降至78～41 篇。分析微核文献的上述年代分布特征,发现它基本反映了我国微核研究的实际情况,如果考虑到在我国论文发表需时1～2 年左右的话,那么上述所有时间分段还需前调1～2 年,即第一阶段: 1978～1981年( < 30篇) ;第二阶段:1982～1991年(30～60篇) ;第三阶段:1992～1996 年( > 100 篇) ;第四阶段: 1997 年后( < 100篇) 。
第一阶段是微核试验引入和初步研究阶段( 1978 ～1981) ,是微核试验在国内引入和初步研究阶段,涉及的研究单位较少,研究人员集中于少数单位。第二阶段(1982～1991) 是微核试验的传播和推广阶段,这十年随着国内几次有影响的微核技术培训班的举办(据不完全统计有5 次,1983 ,1985 ,1987 ,1987 ,1988) ,共培训研究人员300 余人,人员来自近百家大专院校和研究单位,这对微核试验在我国的推广应用起了很大的作用。另外,八十年代中期随着中国环境诱变剂学会成立(1984) ,每2 年举行一次的全国性学术会议,对交流和推动微核技术也起了很好的作用。这一阶段表现为基层卫生防疫组织对这一方法表现出浓厚兴趣,纷纷结合本地实际开展了许多现场职业暴露人群、环境污染现场的评估,以及应用这一方法评估食品、药品、环境污染物等,微核论文数量有了较快增长。第三阶段(1992～1996) 为微核试验的成熟期。经过10 余年的应用和发展,微核试验已在我国预防医学、卫生检验、毒理学、环境科学等多个领域得到广泛普及,研究进入一个高潮,这一时期的突出特点是除了一般性的毒性评价和人群监测外,一些新的微核技术如抗着丝粒抗体染色(CREST 染色) 、荧光原位杂交(FISH) 、自动化检测等微核试验新技术开始占一定的比例[ 14～18 ] ,反映出微核研究不仅数量达到了高峰,而且质量有了较大的提高。第四阶段(1997 年后) 为微核试验的回归期。主要是许多学者在广泛使用了这一方法后,对常规微核试验方法缺乏了新鲜感,而微核实验中新的技术手段和平台虽然正在逐步建立,但技术和仪器设备要求高(如全染色体探针杂交、流式仪自动化检测等) ,基层单位难以推广应用。这一阶段表现为微核文献数量有所下降,研究方向较为分散,无明显热点。
3 从研究材料和方法看微核试验在中国的应用特点
1980～2000 年检索的微核文献使用的研究材料分布见图2 。从图中可以看出,在我国使用淋巴细胞用作人群监测的占44. 7 %(662 篇) ,使用大、小鼠外周血和骨髓红细胞做遗传毒性评估的占39. 3 %(583 篇) ,使用植物(包括紫露草和蚕豆) 材料进行实验的占9. 1 %(135 篇) ,使用生殖细胞材料进行评估的占5. 0 %(74 篇) 。另外,还有使用口腔黏膜和肝细胞的各约占1 %。从以上统计数据可以看出,国外开展微核实验所使用的材料在我国基本上均有应用。但明显可以看出,我国微核实验更偏重于以人淋巴细胞为主的人群监测(所占比例最高) ,这与国外微核以实验室研究为主有所不同(国外以动物实验为主) 。反映出我国学者更关心解决人民生产和生活中的实际问题,许多论文都是工作在基层卫生防疫部门的同志撰写的,他们更关心使用这一方法解决实际问题。另外,也说明在我国易找到实验现场,采样较为方便,这是我国微核研究的优势所在。
4 我国微核研究的一些特色性工作
我国微核研究工作虽然起步比国外晚5 年左右时间,但后来推广普及较快,在多年的研究工作中也形成了自己的一些特色和创新,可以概括为以下几个方面:
4.1 提出了间期细胞核以核芽突方式形成微核的学说[ 19～21 ] ,并建立了末稍血( G0 期) 微核测试法。国际上普遍认为微核来源于染色体断片或丢失的整条染色体,根据这一理论,细胞必须经过分裂后,才能观察到微核。但国内薛开先采用放射自显影、间期细胞及各周期微核定量分析等手段,于1986 年首先提出了间期细胞可以以核芽突方式形成微核学说。曹佳使用BrdU 标记和电镜技术,也证实了这一途径可以解释部分微核的形成[ 20～21 ] 。两学者的工作同时认为:这一途径与染色体断片和染色体丢失形成微核理论并不矛盾,都是遗传物质的丢失,具有相同的遗传毒理效应。根据这一新的论点,在人群监测中采集的外周血不需培养,即可直接在外周血淋巴细胞中观察到微核的存在。据此薛开先教授在八十年代初期在国内外首先成功地建立了人微量末稍血淋巴细胞( G0 期) 微核测试法并不断改进[ 1 ,11 ,13 ] ,广泛地用于有害职业人群遗传损害评价,均取得了成功。举办了6 期全国性学习班,为21 个省市培训人员近300 人,使这一技术在国内获得较大范围的推广,部分单位并取得成果。上述事实表明,微核可由间期核直接形成的研究,从理论到实践都是比较成功的。最近,国际人类微核协作研究项目,已将未分裂淋巴细胞微核形成纳入第二阶段研究内容,以便在全球范围内得到认证。
4. 2 对微核结构、功能进行了较系统研究。如曹佳等采用电镜、BrdU 标记、DNA 探针杂交等技术[ 22～24 ] ,发现部分淋巴细胞微核具有一定的结构和功能,部分微核具有DNA 复制能力,不同诱变剂诱导的微核具有不同的染色体组成,并有一定的规律性。如非整倍体断裂剂诱导的微核,主要由丢失的整条染色体组成,染色体断裂剂诱导的微核,主要由染色体断片组成。上述认识对于进一步认清微核形成机理和更有效、更合理地使用这一方法,具有一定的指导意义。
4. 3 用于现场和职业暴露人群的遗传损害监测具有面广和深入的特点,所得到的大量结果为各级行政管理部门决策立法,以及保护人民健康,做出了积极的贡献。如我国学者开展的焦炉厂人群、苯接触人群、防老剂D 接触人群、重金属砷、铅、锰、汞接触人群都显示微核是监测遗传损害的良好生物标志物(biomarker) [ 25～27 ] 。同时,我国学者对射线工作人员,生活方式和环境污染等方面也做了大量人群监测工作。
5 我国微核试验的不足及展望
微核试验在我国的应用经历了传入、推广、普及、高潮到回落的一个发展阶段,回顾我国的微核研究情况,发现存在以下不足:
5. 1 跟踪研究多,原创性工作不够。微核试验从产生到现在,都是一个不断拓展、不断创新的过程,但纵观近20 年来的发展,不管从原理到新技术方法,绝大多数都是国外学者提出来的,属于我国学者原创性的工作并不多。
5. 2 机理研究深入不够,新的检测技术探索不够。基础理论研究对于指导技术和方法的应用,具有重要的意义。国外非常重视新的理论的提出。近年来,国际上提出了新微核实验的概念,将微核实验用于包括染色体不分离、分裂延迟、分裂不平衡、基因扩增、Hprt 基因突变等多个遗传学终点的检测,因而大大拓展了微核试验的应用范围[ 9 ,28 ,29 ] 。当然,要实现一个实验多个遗传损害终点的检测,需要更多的新的技术手段配合,如FISH 技术、图象分析技术等等,这也对我国的实验室条件和研究水平提出了更高的要求。而国内许多学者对微核试验存在认识上的误区,仅仅将其作为一种简单的遗传损害指标应用,不愿从机理到方法做更深入研究。
5. 3 技术和方案的标准化工作基本未开展。这样造成不同实验室之间结果波动大、数据难以进行比较。而发达国家非常重视这一工作,如日本曾成立全国性的微核协作研究组,从小鼠的品系、性别、年龄、给药方式、染毒途径、制片方法、染色方法等各个环节入手,详细研究各因素对微核试验的影响,最终提出最佳实验方案[ 30 ] 。1997 年成立的国际人群微核协作小组,共有16 个国家28 个实验室参加,所提出的第一阶段研究计划,也是实验室之间方法的比较和统一,并为此开展了统一的对比研究[ 31 ] 。
随着微核试验检测范围的进一步拓宽,新微核试验正向我们走来,我国学者应加强对这一方法的研究, 加大新技术示范与推广的力度,以缩小与国际同类研究的距离。
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